高效液相色谱仪器

1、进样口进样口检测器检测器色谱图色谱图色谱柱色谱柱溶剂溶剂高压泵高压泵混合器混合器第四节第四节 高效液相色谱仪简介高效液相色谱仪简介贮液罐与流动相脱气高压泵和梯度洗脱系统 进样装置 色谱柱与柱温箱贮液罐与流动相脱气l1贮液罐： 耐腐蚀；耐腐蚀； 0.52L0.52L； 高于泵体；高于泵体； 密闭；密闭； 溶剂经溶剂经0.45m0.45m滤膜除机械杂质；滤膜除机械杂质； 输出流动相管路插入一端连接输出流动相管路插入一端连接0.45m0.45ml 孔径过滤器的贮液瓶中孔径过滤器的贮液瓶中l2流动相脱气处理：超声脱气、在线真空脱气 除去其中溶解的气体 防止产生气泡对基线噪音和灵敏度造成的影响 防止某些

2、组分氧化变性对色谱柱分离性能的影响高压输液泵高压输液泵要求：要求：1. 1.泵体耐腐蚀；泵体耐腐蚀； 2. 2.能在高压下连续工作；能在高压下连续工作； 3. 3.输出流量范围宽；输出流量范围宽； 4. 4.输出流量稳定，重复性好输出流量稳定，重复性好类型：类型：1. 1.恒流泵恒流泵 ：输出恒定体积流量流动相。：输出恒定体积流量流动相。注射泵（螺旋泵）注射泵（螺旋泵） 2. 2.恒压泵（恒压泵（气动放大泵）：输出压力恒定，系统气动放大泵）：输出压力恒定，系统 阻力不变时阻力不变时流量恒定；流量恒定；系统阻力改变时系统阻力改变时流量不流量不 恒定。恒定。l柱塞向前运动，液体输出，流向色谱柱；l

3、向后运动，将贮液瓶中液体吸入缸体；l前后往复运动，流动相源源不断输送到色谱柱中。球形单向阀球形单向阀宝石柱塞宝石柱塞 梯度洗脱是使流动相中含有两种或两种以上不同梯度洗脱是使流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程中连续或间断改变流动相组极性的溶剂，在洗脱过程中连续或间断改变流动相组成，以调节流动相极性，使每个流出组分都有合适的成，以调节流动相极性，使每个流出组分都有合适的容量因子，以适用的分离度获得圆满的选择性分离。容量因子，以适用的分离度获得圆满的选择性分离。 梯度洗脱技术的优点是：梯度洗脱技术的优点是：可提高柱效、缩短分析可提高柱效、缩短分析时间，也可改善检测器的灵敏度。时间，

4、也可改善检测器的灵敏度。当样品第一个组分当样品第一个组分的的k k 和最后一个峰的和最后一个峰的k k 相差几十倍至百倍时，采用梯度相差几十倍至百倍时，采用梯度洗脱效果最好。此技术与气相色谱法中的程序升温相洗脱效果最好。此技术与气相色谱法中的程序升温相似。似。 梯度洗脱方式有两种：梯度洗脱方式有两种：低压洗脱低压洗脱和和高压洗脱高压洗脱低压梯度洗脱系统：低压梯度洗脱系统：l 常压下将溶剂按程序混合，用一台高压泵送入色谱柱常压下将溶剂按程序混合，用一台高压泵送入色谱柱 高压梯度洗脱系统：高压梯度洗脱系统：l 两台高压泵将溶剂增压后送入梯度混合室混合，再送两台高压泵将溶剂增压后送入梯度混合室混合，

5、再送入色谱柱入色谱柱定量阀定量阀进样进样阀阀流出液流出液阻尼器阻尼器清洗阀清洗阀溶剂溶剂脱气机脱气机柱子柱子高压泵高压泵多溶剂单泵低压梯度装多溶剂单泵低压梯度装 置置1. 1.隔膜进样（早期）隔膜进样（早期）2. 2. 六通阀进样六通阀进样 阀体为不锈钢材料，旋转密封部分由坚硬的合金阀体为不锈钢材料，旋转密封部分由坚硬的合金陶瓷制成。耐磨、密封性好。陶瓷制成。耐磨、密封性好。3. 3.自动进样器自动进样器 自动进样器是由计算机自动控制定量阀，按事先自动进样器是由计算机自动控制定量阀，按事先编制注射样品的操作程序工作。取样、进样、样品管编制注射样品的操作程序工作。取样、进样、样品管路清洗和样品盘

6、的转动均按预定程序自动进行，一次路清洗和样品盘的转动均按预定程序自动进行，一次可进行上百个样品分析。可进行上百个样品分析。色谱柱色谱柱一、柱材料及规格一、柱材料及规格 1. 柱材料：内壁抛光的不锈钢管。柱材料：内壁抛光的不锈钢管。 2.柱规格：直型。内径柱规格：直型。内径4.6mm或或3.9mm;长度长度1050cm;二、柱连接方式二、柱连接方式 柱柱接头通过过滤片与色谱接头通过过滤片与色谱 柱管连接，在色谱柱管上下两柱管连接，在色谱柱管上下两 端安装过滤片，一般用不锈钢端安装过滤片，一般用不锈钢 烧结材料。烧结片上的孔径小于烧结材料。烧结片上的孔径小于 填料颗粒粒径，可让流动相顺利填料颗粒粒

7、径，可让流动相顺利 通过，并可阻挡流动相中的机械通过，并可阻挡流动相中的机械 杂质以保护色谱柱。杂质以保护色谱柱。三、柱温控制三、柱温控制 四、柱填充技术四、柱填充技术 填充色谱柱的方法，根填充色谱柱的方法，根据固定相微粒大小有干法和据固定相微粒大小有干法和湿法两种。湿法两种。 d20m干法填充干法填充 d10m湿法填充湿法填充 （匀浆法）（匀浆法）五、色谱柱的的测试与维护五、色谱柱的的测试与维护 无论自制和商品色谱柱，还是在使用过程中的色谱柱，无论自制和商品色谱柱，还是在使用过程中的色谱柱，有必要进行测试以掌握色谱柱的使用情况。各种类型的色谱有必要进行测试以掌握色谱柱的使用情况。各种类型的色

8、谱柱应选用不同的色谱系统进行测试，目前商品柱都附有测试柱应选用不同的色谱系统进行测试，目前商品柱都附有测试条件和报告。条件和报告。 1. 1. 色谱柱使用过程中注意事项色谱柱使用过程中注意事项（1 1）仪器与柱子连接时，不要用力过大）仪器与柱子连接时，不要用力过大（2 2）进样前，样品要处理。）进样前，样品要处理。（3 3）更换流动相时，根据流动相性质选择合适的溶剂冲洗仪）更换流动相时，根据流动相性质选择合适的溶剂冲洗仪 器和色谱柱，防止流动相不相溶或盐析出，堵塞柱子。器和色谱柱，防止流动相不相溶或盐析出，堵塞柱子。（4 4）柱子存放过程应密闭，防止柱库干枯，定期冲洗。）柱子存放过程应密闭，防

9、止柱库干枯，定期冲洗。 2. 2. 色谱柱再生色谱柱再生 检测器是高效液相色谱仪中的三大部件之一检测器是高效液相色谱仪中的三大部件之一（高压输液泵、色谱柱、检测器），主要用于检测（高压输液泵、色谱柱、检测器），主要用于检测经色谱柱分离后的组分浓度的变化。经色谱柱分离后的组分浓度的变化。 检测器应具备如下特征：检测器应具备如下特征： 灵敏度高；对组分的响应速度快；响应对流动灵敏度高；对组分的响应速度快；响应对流动相流量和温度变化不敏感；不引起柱外峰展宽；线相流量和温度变化不敏感；不引起柱外峰展宽；线性范围宽；适用范围广。但至今没有一种检测器能性范围宽；适用范围广。但至今没有一种检测器能完全具备这

10、些特征。完全具备这些特征。 l1按适用类型分类 选择性检测器选择性检测器：只选择性对某些物质有响应：只选择性对某些物质有响应 通用型检测器通用型检测器：对所有物质有响应：对所有物质有响应l2按测量信号性质分类 浓度敏感型检测器浓度敏感型检测器：响应值正比于溶质在流动相中的浓度：响应值正比于溶质在流动相中的浓度 样品量一定时，检测器瞬间响应样品量一定时，检测器瞬间响应质量敏感型检测器质量敏感型检测器：响应值正比于单位时间通过检测器的物质的：响应值正比于单位时间通过检测器的物质的量量 CR dtdwR uAuh1无关，与uhuA无关，与l1 1噪声与基线漂移噪声与基线漂移l2 2灵敏度灵敏度l3

11、3检测限检测限( (最小检测量和最小检测浓度最小检测量和最小检测浓度) )l4 4线性范围线性范围l5 5定性定量重现性定性定量重现性l6 6检测器的池体积检测器的池体积紫外检测器（UVD） 紫外检测器是高效液相色谱仪使用最广泛的一种检紫外检测器是高效液相色谱仪使用最广泛的一种检测器，它分为：测器，它分为：1. 1.固定波长紫外检测器；固定波长紫外检测器；2. 2. 可变波长紫可变波长紫外检测器外检测器；3. 3.光电二极管矩阵检测器光电二极管矩阵检测器 三种类型，下面简三种类型，下面简单介绍如下：单介绍如下： 1. 1. 固定单波长式紫外检测器固定单波长式紫外检测器l光源光源: :低压汞灯低

12、压汞灯l检测波长检测波长: :固定于固定于254254nmnml灵敏、稳定、方便、灵敏、稳定、方便、经济经济2. 2.可变波长紫外检测器可变波长紫外检测器 可变波长紫外检测器可变波长紫外检测器3. 3.光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 光电二极管阵列检测器在内部结构上与分光式检测器的光电二极管阵列检测器在内部结构上与分光式检测器的光路有本质差别，其特点式整个检测器无运动部件，性能稳定。光路有本质差别，其特点式整个检测器无运动部件，性能稳定。分光式检测器光学系统属于正相系统，即光源经分光后单色光分光式检测器光学系统属于正相系统，即光源经分光后单色光照射流通池，光电二极管阵列检测器光学系统

13、属于反置光学系照射流通池，光电二极管阵列检测器光学系统属于反置光学系统（如图），光源经聚光后，直接照射流通池，其透射光经光统（如图），光源经聚光后，直接照射流通池，其透射光经光栅分光，分光范围栅分光，分光范围200400nm，分出的光由几百个单元组成的分出的光由几百个单元组成的光电二极管阵列所接受，每一个二极管接受一个特定波长的信光电二极管阵列所接受，每一个二极管接受一个特定波长的信号，经电子束扫描和光电转换，反映出每一个光电二极管的信号，经电子束扫描和光电转换，反映出每一个光电二极管的信息。经计算机计处理，可获得定量定性的色谱光谱信息。息。经计算机计处理，可获得定量定性的色谱光谱信息。 DA

14、D检测器的特点：检测器的特点： 1. 可以获得多个波长的色谱图，因此可以计算不同波长可以获得多个波长的色谱图，因此可以计算不同波长的吸收比。的吸收比。 2.可在色谱分离期间，对每个色谱峰的指定位置实时记录可在色谱分离期间，对每个色谱峰的指定位置实时记录吸收光谱图。如果每个色谱峰记录三个位置的光谱图（峰前吸收光谱图。如果每个色谱峰记录三个位置的光谱图（峰前沿、峰顶点、峰后沿），通过比较三个位置的光谱图，可判沿、峰顶点、峰后沿），通过比较三个位置的光谱图，可判别色谱峰的纯度机分离情况。别色谱峰的纯度机分离情况。 3.在色谱运行期间可以进行逐点光谱扫描，得到时间波在色谱运行期间可以进行逐点光谱扫描，

15、得到时间波长吸光度三维图形。由于每一个组分均有全波段的吸收光长吸光度三维图形。由于每一个组分均有全波段的吸收光谱图，因此可利用色谱保留值规律和光谱吸收曲线综合进行谱图，因此可利用色谱保留值规律和光谱吸收曲线综合进行定性分析。定性分析。波长波长可的松可的松氟美松氟美松皮质酮皮质酮荧光检测器（荧光检测器（FDFD）l原理原理：l 许多有机药物，特别是芳香族药物、被一定强度和波长的紫外光照射后，许多有机药物，特别是芳香族药物、被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。发射出较激发光波长要长的荧光。但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。l F=2.

16、303KQIF=2.303KQI0 0 bcbc ( (低浓度时低浓度时) )l特点特点: :l1. 1.噪音较大噪音较大. . 噪音水平：噪音水平：1010-3-3mVmVl2.2.极其灵敏极其灵敏. . 最小检测限最小检测限:10:10-13-13 g/mlg/mll3.3.线性范围很宽，可达线性范围很宽，可达10106 6l4.4.适于梯度洗脱适于梯度洗脱, ,受温度影响小受温度影响小l5.5.可进行定量分析的浓度型检测器可进行定量分析的浓度型检测器l6. 6. 与与UVDUVD相比相比l 有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度、线性要比紫外检测法有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度、

17、线性要比紫外检测法l高高2 2- -3 3个数量级，特别适合于药物和生物化学样品的分析。个数量级，特别适合于药物和生物化学样品的分析。示差折光检测器（示差折光检测器（DRD） 示差折光检测器是通过连续监测参比池和测量池中溶示差折光检测器是通过连续监测参比池和测量池中溶液的折光率之差来测定样品浓度的检测器。由于每种物质液的折光率之差来测定样品浓度的检测器。由于每种物质都有不同的折光率，因此示差折光监测器属于通用检测器。都有不同的折光率，因此示差折光监测器属于通用检测器。特点特点：l通用型的检测器通用型的检测器l可进行定量分析的浓度型检测器可进行定量分析的浓度型检测器l噪音很小噪音很小. . 噪音

18、水平：噪音水平：1010- -mVmVl灵敏度很差灵敏度很差. . 最小检测限最小检测限:10:10- - 10 10- - g/mlg/mll线性范围较窄，仅为线性范围较窄，仅为1010l不不适于梯度洗脱适于梯度洗脱, ,受温度、环境条件影响很受温度、环境条件影响很 大大蒸发光散射检测器（蒸发光散射检测器（ELSDELSD） 蒸发光散射检测器是蒸发光散射检测器是20世纪世纪90年代出现的最新型的通用年代出现的最新型的通用检测器。理论上可用于挥发性低于流动相的任何组分，但由检测器。理论上可用于挥发性低于流动相的任何组分，但由于它对有紫外吸收的样品组分的检测灵敏度较低，因而主要于它对有紫外吸收的样品组分的检测灵敏度较低，因而主要用于糖类、高