免疫化学诊断技术分类与局限

1、免疫化学诊断技术分类与局限 酶联化学发光酶联化学发光 偏振荧光偏振荧光 时间分辨荧光时间分辨荧光 电化学发光电化学发光 直接化学发光直接化学发光免疫免疫同位素标记同位素标记測定測定法法放射免疫法已有放射免疫法已有3030多年历史。比较其它多年历史。比较其它传统的方法，它有特异性好，灵敏度传统的方法，它有特异性好，灵敏度高，准确性好，可靠性强等特点，故高，准确性好，可靠性强等特点，故在临床科研上广泛使用。在临床科研上广泛使用。免疫同位素標記法之局限免疫同位素標記法之局限 免疫免疫化学发光法化学发光法免疫化学发光法简介免疫化学发光法简介u原理：原理：u抗体包被的塑料固相抗体包被的塑料固相u参加待测

2、样本参加待测样本 - - 抗原抗原u参加碱性磷酸酶标记的抗体参加碱性磷酸酶标记的抗体u洗洗u参加底物参加底物 - 4-Mup, - 4-Mup, 发光发光u产品：产品：u雅培雅培Axsym, Axsym, 梅里埃梅里埃Vidas, Vidas, 强生强生Vitros, Vitros, uDPC Immulite 2000, DPC Immulite 2000, 罗氏罗氏ES300ES300u原理：原理：u標記在小分子抗原上的熒光素經標記在小分子抗原上的熒光素經485nm485nm的激發偏振光照射後，發出光的激發偏振光照射後，發出光子，經過偏振儀形成子，經過偏振儀形成525550nm525550

3、nm的偏振光；的偏振光；u這一偏振光的強度與熒光素受激發時分子轉動的速度呈反比，游離的熒這一偏振光的強度與熒光素受激發時分子轉動的速度呈反比，游離的熒光素標記抗原，分子小，轉動速度快，激發後發射的光子散向四面八方光素標記抗原，分子小，轉動速度快，激發後發射的光子散向四面八方，因此偏振光信號弱；，因此偏振光信號弱；u在測定過程中待測抗原小分子，熒光標記抗原小分子和特導性沆體大分在測定過程中待測抗原小分子，熒光標記抗原小分子和特導性沆體大分子同時参加到一反應杯中，待測抗原越少，與抗體競爭結合的量越少，子同時参加到一反應杯中，待測抗原越少，與抗體競爭結合的量越少，而熒光標記抗原與抗體結合就越多，而熒

4、光標記的小分子抗原與大分子而熒光標記抗原與抗體結合就越多，而熒光標記的小分子抗原與大分子抗體結合後，其分子的轉動速度減慢，由此熒光偏振信號強。抗體結合後，其分子的轉動速度減慢，由此熒光偏振信號強。u产品：雅培产品：雅培AxsymAxsym免疫化学发光法简介免疫化学发光法简介u原理：原理：标记物为三價稀土離子如标记物为三價稀土離子如：銪銪 ( (EuEu3+3+) )、釤釤( (SmSm3+3+) )、鏑鏑( (Dy3+)Dy3+)和和鋱鋱( (Tb3+)Tb3+)等，它們可利用具有雙功能基團結構的螫合劑，等，它們可利用具有雙功能基團結構的螫合劑，在水溶液中與抗原分子以共軛雙鍵結合，形成稀土離子

5、在水溶液中與抗原分子以共軛雙鍵結合，形成稀土離子螫合劑螫合劑抗原結合物。抗原結合物。當當與與共同與抗體競爭結合，形成抗共同與抗體競爭結合，形成抗原抗體免疫復合物，其中含有標記稀土離子，然後利用時間分辨熒原抗體免疫復合物，其中含有標記稀土離子，然後利用時間分辨熒光分析儀，可測出復合物中稀土離子發射熒光的強度，以此確定待光分析儀，可測出復合物中稀土離子發射熒光的強度，以此確定待測抗原的含量測抗原的含量。u产品：产品：EG&GEG&G的的DELFIADELFIA免疫化学发光法简介免疫化学发光法简介u原理：原理：u先將特异性抗體包被在磁性微珠。另外將發光劑先將特异性抗體包被在磁性微珠。

6、另外將發光劑Ru (bpy)32+Ru (bpy)32+標記在標記在特异性抗體上。特异性抗體上。u將待測樣本與包被抗體的磁性微珠和發光劑標記的抗體共同溫育，將待測樣本與包被抗體的磁性微珠和發光劑標記的抗體共同溫育，形成磁性微珠包被抗體形成磁性微珠包被抗體抗原抗原發光劑標記杭體復合物。發光劑標記杭體復合物。u参加参加TPATPA緩沖液和緩沖液和TPATPA在電極外表進行電子轉移，產生電化學發光。在電極外表進行電子轉移，產生電化學發光。u产品：产品：u罗氏罗氏ElecsysElecsys免疫化学发光法简介免疫化学发光法简介免疫化学发光法简介免疫化学发光法简介u原理：利用化學發光技術和磁性微粒子分離

7、技術相結合的測定原理：利用化學發光技術和磁性微粒子分離技術相結合的測定方法。以丫啶酯為發光的標記物，固相載體為極細小的磁性顆方法。以丫啶酯為發光的標記物，固相載體為極細小的磁性顆粒。其測定原理與放射免疫和聯免中的雙抗體夾心法和競爭結粒。其測定原理與放射免疫和聯免中的雙抗體夾心法和競爭結合法相似。合法相似。u單克隆抗體或抗原包被磁性微粒單克隆抗體或抗原包被磁性微粒u抗原抗體結合，洗滌分離抗原抗體結合，洗滌分離u参加氧化劑發光：經過参加氧化劑参加氧化劑發光：經過参加氧化劑H2O2H2O2和和 pH pH 糾正液糾正液NaOHNaOH使成鹼性，這時丫啶酯在不需要催化劑的情況下分解、使成鹼性，這時丫啶

8、酯在不需要催化劑的情況下分解、發光，集光器和光電倍增管接收。記錄發光，集光器和光電倍增管接收。記錄5 5秒鐘內所產生的光子能秒鐘內所產生的光子能。u产品：产品：u拜耳拜耳ACS:180SE, Advia Centaur, Advia IMSACS:180SE, Advia Centaur, Advia IMS免疫化学发光法简介免疫化学发光法简介直接化學發光的机理直接化學發光的机理 - - ACRIDINE ESTERACRIDINE ESTER丫啶酯丫啶酯u最 簡 易 u最 快 速 非常稳定；非常稳定；与抗体或抗原结合不影与抗体或抗原结合不影响发光；响发光；N+CH3BrCOOCH3CH3R丫

9、啶酯丫啶酯 - - ACRIDINE ESTERACRIDINE ESTER不需催化劑不需催化劑 穩定性高穩定性高 產光強產光強 線性好線性好 本底低本底低 反應快反應快 結合后不影響發光結合后不影響發光 靈敏度高靈敏度高 - - 可達可達1010-15-15 摩爾摩爾直接化學發光的机理直接化學發光的机理丫丫丫丫 啶啶啶啶 酯酯酯酯 一一一一 直直直直 接接接接 閃閃閃閃 光光光光 ，強強強強 度度度度 是是是是 碘碘碘碘125 125 125 125 在在在在 一一一一 分分分分 鐘鐘鐘鐘 發發發發 出出出出 光光光光 子子子子 的的的的 十十十十 万万万万 倍倍倍倍0 06.06.05.0

10、5.02.02.01.01.00 0200,000200,000400,000400,000600,000600,000800,000800,0001,000,0001,000,0003.03.04.04.0秒秒100100200200300300400400500500600600直直 接接 閃閃 光光 慢慢 發發 光光 光光 強強 度度直直 接接 閃閃 光光 慢慢 發發 光光 直接化學發光的机理直接化學發光的机理Tracer Concentration (moles/L)sensitivity limitof fluorescencesensitivity limit ofchemilum

11、inescenceFluorescenceFluorescenceBackground Noise LevelBackground Noise LevelChemiluminescenceChemiluminescenceBackground LevelBackground Level 1010998877665 544332 21 1001010-15.51010-171010-161010-151010-141010-131010-121010-101010-91010-81010-11RelativeRelative LightLight IntensityIntensitytracer

12、 signal直接化學發光的机理直接化學發光的机理直直直直 接接接接 化化化化 學學學學 發發發發 光光光光 不不不不 受受受受 pHpH 和和和和 溫溫溫溫 度度度度 影影影影 響響響響nn減輕漂移減輕漂移nn提高重复性提高重复性丫啶丫啶 酯直接發光酯直接發光CL(AE)CL(AE)電電 化化 學學 發發 光光 ECL(TU + TPA)ECL(TU + TPA)信 號 的 產 生丫啶 酯 与 H2 O 2 的 簡 單反 應需 三 個 電 板 去 激 發 由 几 個分 子 態 參 加 的 复 雜 反 應速 度不 到 2 秒5 秒， 但 洗 電 极 需 40 60 秒靈 敏 度10-15 M，

13、足 以 滿 足 免疫 試 驗 的 要 求10-11 - 10-17 M本 底极 低較 高，過 剩 的 TPA會 發 光特 异 性不 受 溫 度 与 pH 的影響受 pH, 金 屬 及 螯 合 物 影 響直接化學發光与电化學發光比较直接化學發光与电化學發光比较信信 號號 的的 產產 生生丫啶丫啶 酯酯 与与 H H2 2O O2 2 的的 簡簡 單單反反 應應需需 三三 個個 電電 板板 去去 激激 發發 由由 几几 個個分分 子子 態態 參參 加加 的的 复复 雜雜 反反 應應速速 度度不不 到到 2 2 秒秒5 5 秒，秒， 但但 洗洗 電電 极极 需需 40- 60 40- 60秒秒靈靈

14、敏敏 度度10-10-1515 M M，足，足 以以 滿滿 足足免疫免疫 試試 驗驗 的的 要要 求求1010-11-11 - - 10-10-1717 M M本本 底底极极 低低較較 高，過高，過 剩剩 的的 TPATPA會會 發發 光光特特 异异 性性不不 受受 溫溫 度度 与与 pH pH 的的影響影響受受 pH, pH, 金金 屬屬 及及 螯螯 合合 物物 影影 響響微顆粒微顆粒粗顆粒粗顆粒 Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY

15、 YY YY Yu功能功能u抗原抗体反應相抗原抗体反應相u結合与未結合的别离結合与未結合的别离u特點特點u縮縮 短短 擴擴 散散 距距 离离 u提提 高高 捕捕 獲獲 效效 率率 u表表 面面 面面 積積 為為 包包 覆覆 的的 試試 管管 和和 玻玻 璃璃 珠珠 之之 50 50倍倍 有有 利利 于于 結結 合合 動動 力力 學學u提提 供供 更更 高高 之之 靈靈 敏敏 度度 微磁顆粒技術微磁顆粒技術扁平的設計結合相磁場狄窄空間以利快速抽吸吸液探針u以以 便便 最最 怏怏 速速 , , 最最 干干 凈凈 地地 别离别离 結結 合合 物物 与与 未未 結結 合合 物物 u以以 便便 獲獲 得

16、得 高高 靈靈 敏敏 度度 及及 高高 重重 复复 性性試試 杯杯 的的 最最 佳佳 設設 計計 - - 配配 合合 微微 磁磁 粒粒 体体 技技 術術 降降 低低 人人 抗抗 鼠鼠 抗抗 体体 ( (HAMA) HAMA) 的的 干干 扰扰為為 大大 分分 子子 的的 測測 定定 提提 供供 了了 高高 靈靈 敏敏 度度 和和 高高 特特 异异 性性反响过程的结构设计反响过程的结构设计 - - 單單 - - 多多 抗抗 体标记法体标记法是是 一一 种种 确确 保保 高高 靈靈 敏敏 度度 同同 時時 又又 廣廣 譜譜 的的 設設 計計反响过程的结构设计反响过程的结构设计- - 抗体抗体 一一

17、 步步 標標 記記 法法磁颗粒磁颗粒ACS:180 SE ACS:180 SE 之之 特特 性性u隨 机 存 取 u直 接 化 學 發 光 u台 型 設 計 u180 測 試 /小 時 u十 五 分 鐘 內 首 次 結 果 u自 動 重 复 功 能u自 動 机 內 稀 釋 u凝 塊 識別u兼 容 原 樣 品 試 管 u條 碼 識 別 u60 個 樣 品 容 量 u緊 急 樣 品 容 納 u机 上 容 納 十 三 种 項 目 u試 劑 清 單 u微 量 固 相 廢 物 u質 控 報 告 儲 存 u机上儲存質詢，電影演示u一小時离机u雙 向 界 面 u宿 主 詢 問u廣 譜 試 驗 項目系列 u實

18、 驗 室 自 動 化 匹 配 臨臨 床床 應應 用用 工程工程 按按 疾疾 病病 分分 類類u甲甲 狀狀 腺腺 功功 能能 T4, T3, TUp, FT4, FT3, TSH, T4, T3, TUp, FT4, FT3, TSH, TSH-3TSH-3u生生 殖殖 系系 統統 ThCG, LH2, FSH, Estradiol, ThCG, LH2, FSH, Estradiol, Estradiol6-II, Progesterone, Estradiol6-II, Progesterone, Prolactin, TestosteroneProlactin, Testosteroneu

19、內內 分分 泌泌 Cortisol (serum+urine)Cortisol (serum+urine)u貧貧 血血 B12, Ferritin, Folate, RBC FolateB12, Ferritin, Folate, RBC Folateu心心 血血 管管 CK-MB, Myoglobin, Troponin ICK-MB, Myoglobin, Troponin Iu 腫腫 瘤瘤 標標 記記 CEA, AFP, PSA2, fPSA, CEA, AFP, PSA2, fPSA, CA15-3 , CA125, CA19-9 CA15-3 , CA125, CA19-9u 藥藥

20、濃濃 度度 監監 測測 Digoxin, Theophylline, Digoxin, Theophylline, Phenobarbital, Phenytoin, Phenobarbital, Phenytoin, Vancomycin, Gentamicin, Vancomycin, Gentamicin, Digitoxin, Carbamazepine Digitoxin, Carbamazepineu 骨骨 代代 謝謝 DeoxypyridinolineDeoxypyridinolineu 過過 敏敏 Total IgETotal IgE發發 展展 中中 新新 項項 目目 uIns

21、ulin, C-peptide, anti-insulinInsulin, C-peptide, anti-insulinuDHEA-SulfateDHEA-SulfateuSHBGSHBGuTobramycin, QuinidineTobramycin, QuinidineuHomocysteineHomocysteineubeta-2 microglobulin beta-2 microglobulin uE3E3uAnti-TPOAnti-TPOuAnti-TGAnti-TGuEquimolar PSAEquimolar PSAuComplex PSAComplex PSAuHER-2/

22、neuHER-2/neu免疫化學定量分析之進化免疫化學定量分析之進化7979年年IRMAIRMA8888年年半自動半自動MagicMagic9191年年ACS:180ACS:1807070年代中年代中商業化商業化RIARIA6060年代初年代初研究研究RIARIA以以 TSH TSH 甲狀腺刺激素試驗為例甲狀腺刺激素試驗為例免疫化學方法靈敏度之提高免疫化學方法靈敏度之提高 1010-16-16 M M1010-11-11 M M1010-12-12 M M免疫熒光免疫熒光 免疫媒標免疫媒標 放射免疫放射免疫 直接化學發光直接化學發光1010-11-11 -10 -10-17-17 M M免疫傳

23、感技術免疫傳感技術免疫免疫PCRPCR技術技術? ? M M電化學發光電化學發光免疫熒光偏振免疫熒光偏振ACS:180 ACS:180 系系 列列 發發 展展 史史 u1974 - 1974 - 首創微玻璃珠放免法首創微玻璃珠放免法 u1978 - 1978 - 首次首次FT4 FT4 放免法放免法u1979 - 1979 - 首次首次 TSH TSH 放免法放免法u1982 - 1982 - 首次維生素首次維生素12/12/葉酸固相法葉酸固相法u1983 - 1983 - MAGIC MAGIC 上市上市u1986 - 1986 - 首次直接化學發光免疫分析儀首次直接化學發光免疫分析儀 -

24、- MAGIC LITEMAGIC LITEu1991 - 1991 - 首次全直動首次全直動隨机存取隨机存取之化學發光免疫分析儀之化學發光免疫分析儀 - - ACSACSu1992 - 1992 - 首次全直動維生素首次全直動維生素12/12/葉酸測定葉酸測定u1993 - 1993 - 延長操作附件延長操作附件u1994 - 1994 - 首次凝塊探測功能首次凝塊探測功能u1994 - 1994 - ACSACS通過通過ISO9001ISO9001標准標准心血管系统心血管系统如何能如何能更快更快更准确更准确更全面的更全面的诊断诊断AMIAMI时心电图并不能典型归类时心电图并不能典型归类诊断

25、急性心肌堵塞之困难诊断急性心肌堵塞之困难 一半有不稳定胸口窒息痛的病人，入一半有不稳定胸口窒息痛的病人，入 院院 病人重发堵塞诊断困难病人重发堵塞诊断困难引致不能及时诊断引致不能及时诊断AMIAMI延迟适当的治疗、护理延迟适当的治疗、护理 临床需要临床需要尽早分辨、准确诊断尽早分辨、准确诊断AMIAMI方法方法肌肉组织肌肉组织心肌心肌心肌细胞特异性标志心肌细胞特异性标志肌钙蛋白肌钙蛋白 I I C C T T肌钙蛋白肌钙蛋白 I I释放入血释放入血c c心肌坏死心肌坏死氨基酸顺序氨基酸顺序4040差异差异心肌细胞心肌细胞肌红蛋白肌红蛋白肌酐激霉肌酐激霉MBMB心肌坏死心肌坏死 释放入血释放入血

26、含量大血液浓度血液浓度明显升高明显升高( (CKCK- -MBMB) )6 65 54 43 32 21 10 4 8 12 16 20 24 48 72 96 0 4 8 12 16 20 24 48 72 96 h h肌红蛋白肌红蛋白CK-MBCK-MB肌钙蛋白肌钙蛋白 浓度急性心肌堵塞后各项指标变化急性心肌堵塞后各项指标变化肌红蛋白肌红蛋白升高升高顶峰顶峰回落回落肌酐激霉肌酐激霉MBMB肌钙蛋白肌钙蛋白I I1-2 1-2 h h4-84-8h h6-86-8h h5-125-12h h10-2410-24h h12-2412-24h h18-3018-30h h48-7248-72h

27、h5-75-7d d肌红蛋白的临床意义肌红蛋白的临床意义急性心梗后最早急性心梗后最早(1-2h)出现的标记出现的标记最早能排除非急性心梗最早能排除非急性心梗阴性预测率为阴性预测率为 99 % 99 %体内周期短，对重发堵塞特别灵敏体内周期短，对重发堵塞特别灵敏有效观察溶栓疗效有效观察溶栓疗效肌钙蛋白肌钙蛋白I I的临床意义的临床意义诊断急性心肌堵塞特异性诊断急性心肌堵塞特异性 98 % 98 % 特异性强、确诊率高特异性强、确诊率高 灵敏度低灵敏度低急性心梗发病后急性心梗发病后6 6 h h才出现，应与肌红蛋白才出现，应与肌红蛋白一同使用一同使用肌钙蛋白肌钙蛋白I I升高即可确诊为升高即可确诊

28、为急性心肌堵塞，得到治疗急性心肌堵塞，得到治疗体内周期长，对外地病人延误求诊亦能诊断体内周期长，对外地病人延误求诊亦能诊断对极轻微的心肌创伤都能检出对极轻微的心肌创伤都能检出胸痛胸痛ECGECG发病发病肌钙蛋白肌钙蛋白I I肌红蛋白肌红蛋白CK-MBCK-MB急性心梗急性心梗+ + + + 8 8 8h h随访随访+ +复发心梗复发心梗肌红蛋白肌红蛋白本卷须知本卷须知肌酐激霉肌酐激霉MBMB骨骼肌损伤骨骼肌损伤肌红蛋白升高肌红蛋白升高肾功能衰竭肾功能衰竭 CKCK- -MB MB 增高增高甲状腺功能诊断甲状腺功能诊断 T3 T4 TSH TSH-3 FrT3 FrT4 Tup肿瘤标志物肿瘤标志

29、物 CA-199 CA-153 CA-125 PSA AFP CEA CACA 系列系列 一组糖粘蛋白类肿瘤标志一组糖粘蛋白类肿瘤标志物，为细胞膜上的糖脂质，因分别被物，为细胞膜上的糖脂质，因分别被鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体199、153、125识别得名。识别得名。乳癌肿瘤标志物乳癌肿瘤标志物存在于胎儿胰、肠、卵巢、子宫、胆上皮等处存在于胎儿胰、肠、卵巢、子宫、胆上皮等处及乳腺癌组织。及乳腺癌组织。 CA 125存在胚胎体腔上皮细胞中，出生后消失，卵存在胚胎体腔上皮细胞中，出生后消失，卵巢癌细胞中重新出现巢癌细胞中重新出现。卵巢癌肿瘤标志物卵巢癌肿瘤标志物 CA 199分布于胎儿胰、胆囊、肝、肠及正常人胰、胆分布于胎儿胰、胆囊、肝、肠及正常人胰、胆管上皮等处。管上皮等处。胃肠癌肿瘤标志物胃肠癌肿瘤标志物 CA 153CA 199 CA 1