蛋白质定量：

1、实验原理BCAbicin chon in i c a cid就是一种稳定得水溶性复合物,在碱性条件下，二 价铜离 子可以被蛋白质复原成一价铜离子，一价铜离子可以与BCA相互作用，两分子得BCA螯合一个铜离子，形成紫色得络合物，该复合物为水溶性，在562 n m处显示强吸光性，在一定浓度范圉内，吸光度与蛋口质含量呈良好得线性关系，制作标准曲线，因此可以根据待测蛋口在 562nm处得吸光度讣算待测蛋白浓度。Cir'STEP 1.Prolein + Cu原理图：步实验准备1 o BCA定量试剂盒:含A液与B液A液:BCA碱性溶液配方:1 %BCA二钠盐,0。4%氢氧化钠,0、1 6%酒石酸

2、钠，2% 无水碳酸钠,0、95%碳酸氢钠,这些液体混合后再调 PH至I 1。25 B液：4%硫酸铜2 ?牛蛋白血清BSA3。待测得蛋白样品实验步骤1 ?配置BCA工作液:将A液与B液摇晃混匀，按照 A:B=50 : 1得比例配置BC A工 作液，充分混匀。BCA工作液室温下24h内稳定，故现用现配2、 配置不同浓度得标准蛋白液BSA ,1ug/ul,2. 5 ug/u 1 ,5 u g/ul,7.5 ug/ul,1 0 ug/u l，待测蛋白样品在什么溶液中，就用该溶液来稀释标准蛋口液如待测样品溶于强RIP A裂解液，那么用强 RIPA裂解液来稀释标准蛋口液。3.取空口组Oug/ul BS A

3、 各浓度得标准蛋口液5ul参加9 6孔板中，巧取待测得 蛋白样品5ul,参加9 6孔板。0.1 ml samplMixworki50partsy + 1MixPS:上图加样得量仅作为参考，蛋白液与BCA匚作液得比比例符合即可、 4。向各孔得蛋白液中参加 30 0 u 1得BCA工作液，混匀,37度放置30分钟，加 样 时应当动作轻柔,防止产生气泡影响读数、 PS:温度与放置时间可以调整，可在 6 0 度放置3 0分钟o r室温放置2小时。5、静置结束后，冷却至室温,用酶标仪测定562 n m岀得吸光度，并制作标准曲线。Incubate: 30 min. at 37 CSpectr oRh(ad

4、b3t meter? %方The n cool6、根拯待测样品得吸光度，比对标准曲线 ,讣算蛋tl得浓度。考前须知BCA 法测定蛋口浓度时，吸光度可随时间得延长不断加深，且显色反响会随温度 升 高而加快，故如果浓度较低，适合较高温度孵育 or 延长孵育时间。标准蛋口液得加量应 X准确，如果加量不准确，会导致制作出来得标准曲线出现偏差，影响待测样品得浓度计算，所以一方面需要用梯度稀释得方法来配置标准蛋口液，另一方面应使用精确度高得移液枪、A 液与 B 液混合可能出现浑浊，此时应成分振荡混匀 , 最后可见透明溶液。 为加快 BCA 法测定蛋口浓度得速度可以适当用微波炉加热 , 但切勿过热。 当结果

5、出现空口组本身就有较高得背景，可用 Bra dford 法重新测定蛋口浓度。 优缺点 优点：测定快速简便 ,45 分钟内完成 准确灵敏，检测浓度为 52 0 0 mg/ml 干扰物质少 ,BCA 法不受大局部样品中得去垢剂等化学物质影响 , 可兼容样品中 高达5% 得 SDS,5%Trit on X-100,5% 得 Twee n 20 在一定浓度范围内，有良好得线性关系 检测不同蛋口质分子得变异系数小于考马斯亮蓝法蛋口定量 缺点：与荧光蛋口质定量等方法相比，属于化学呈色法得 BCA 法检测灵敏度尚不够 蔗糖、尿素、 N II 4 +与 EDTA 影响测定结果BCA 蛋白定量与 B r a d

6、f o rd 法蛋白定量得区别：1 、Bradford 法测得得主要就是碱性氨基酸与芳香族氨基酸, BCA 那么没有选择性亠 2、BCA 法蛋白浓度定量就是二价铜离子在碱性得条件下， 可以被蛋白质复原成一价铜 离 子(biuret rea c tion)-价铜离子与独特得 BCA Solution A (含有BCA)相互作用产 生敏 感得颜色反响、两分子得 BCA 螯合一个铜离子，形成紫色得反响复合物。该水溶 性 得复合物在 562nm 处显示强烈得吸光性，吸光度与蛋白浓度在广泛范围内有良好得 线性关系， 因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。 -Bradford 法蛋白定量就是染料与蛋 白质结合后引起染料最大吸收得改变， 从 46 5nm 变为 595nm, 光吸收增加。蛋白质 染 料复合物具有高得消光系数， 因此大大提高了蛋白质测定得灵敏度, 最低检出量为 lpg蛋白。染料与蛋白质得结合就是很迅速得过程,大约需2m in,结合物得颜色在lh内就是稳定得。一些阳离子，如K + ,Na+,Mg2 + ,(NH 4 ) 2 SO 4