酶联免疫吸附试验

1、酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）病原生物学实验室病原生物学实验室(免疫）免疫）任书荣任书荣一、实验目的一、实验目的l掌握掌握ELISA的原理及方法的原理及方法二、principle： l抗原或抗体能结合到固相载体的表面仍保持其活抗原或抗体能结合到固相载体的表面仍保持其活性；抗原或抗体与酶交联成酶标抗原或抗体后，性；抗原或抗体与酶交联成酶标抗原或抗体后，仍分别保持其免疫活性和酶活性。仍分别保持其免疫活性和酶活性。l酶标抗原或抗体与相应抗体或抗原反应后，结合酶标抗原或抗体与相应抗体或抗原反应后，结合在免疫复合物上的

2、酶遇到相应的底物时，可以催在免疫复合物上的酶遇到相应的底物时，可以催化底物的水解、氧化或还原，从而产生有色物质。化底物的水解、氧化或还原，从而产生有色物质。颜色反应的深浅与相应抗体或抗原量相关。颜色反应的深浅与相应抗体或抗原量相关。l常用的常用的ELISA方法包括：间接法、双抗体夹心法、方法包括：间接法、双抗体夹心法、竞争法等。竞争法等。 ELISA双抗体夹心法双抗体夹心法(sandwich assay)测甲测甲胎蛋白（胎蛋白（-fetal protein, AFP）一、Principle of AFP detectionl用抗用抗AFP抗体包被固相载体，加入待检标本，标抗体包被固相载体，加入

3、待检标本，标本中的本中的AFP与固相载体上的抗体结合，再加入酶与固相载体上的抗体结合，再加入酶标记的抗标记的抗AFP抗体，形成抗体抗体，形成抗体-抗原抗原-酶标抗体复酶标抗体复合物，加底物显色，颜色的深浅与相应合物，加底物显色，颜色的深浅与相应AFP的量的量呈正相关。呈正相关。principleEAFPAb包被固相载包被固相载体体+S显色EE待测待测AFP抗抗AFP-E抗抗AFPMcAb抗体抗体抗抗AFPMcAb抗体抗体AFP双位点一步法：抗双位点一步法：抗AFP不同位点的不同位点的McAb二、material1、AFP检测试剂盒检测试剂盒2、AFP参考标准夜（参考标准夜（0、25、50、10

4、0、200、400ng/ml）。）。3、DW4、终止液（终止液（2M H2SO4）。）。5、酶标测定仪、酶标测定仪、37温箱。温箱。6、微量加样器、滴管、吸水纸等。、微量加样器、滴管、吸水纸等。三、method（一）（一）quantity test1 1、add sampleadd sample 取包被好的酶标孔取包被好的酶标孔7 7孔，进行标记，第孔，进行标记，第1 16 6孔分别加入孔分别加入AFPAFP参考标准夜（参考标准夜（0 0、2525、5050、100100、200200、400ng/ml400ng/ml）各）各50ul50ul。第。第7 7孔加入样品孔加入样品50ul50ul。

5、2 2、每孔加酶结合物、每孔加酶结合物1 1滴，滴，37153715分钟。分钟。3 3、washwash在各孔中加入洗液在各孔中加入洗液2 2滴滴, ,轻轻摇动几下轻轻摇动几下, ,弃之弃之, ,然后用蒸馏水或然后用蒸馏水或自来水加满各孔自来水加满各孔, ,甩掉甩掉, ,反复反复5 5次次, ,最后在吸水纸上拍干最后在吸水纸上拍干. .4 4、显色、显色每孔加底物和显色液各每孔加底物和显色液各1 1滴，轻轻振摇，室温避光反应滴，轻轻振摇，室温避光反应5 5分钟，分钟，加入加入2M H2M H2 2SOSO4 4 100ul100ul终止反应。终止反应。5 5、酶标仪、酶标仪450nm450nm

6、比色，计算结果。比色，计算结果。（二）（二） quality test1Add samplel取包被好的酶标板取包被好的酶标板3各孔，分别加入阴性对照（各孔，分别加入阴性对照（20 ng/ml）、阳性对照（）、阳性对照（400 ng/ml）和待检标本各）和待检标本各50ul，各孔再加入酶结合物，各孔再加入酶结合物1滴滴, 3715分钟。分钟。2 2、washingwashing在各孔中加入洗液在各孔中加入洗液2 2滴滴, ,轻轻摇动几下轻轻摇动几下, ,弃之弃之, ,然后用然后用蒸馏水或自来水加满各孔蒸馏水或自来水加满各孔, ,甩掉甩掉, ,反复反复5 5次次, ,最后在最后在吸水纸上拍干吸水

7、纸上拍干. .3 3、add chromogenadd chromogen每孔加底物和显色液各每孔加底物和显色液各1 1滴，轻轻振摇，室温避光反滴，轻轻振摇，室温避光反应应5 5分钟，观察结果。分钟，观察结果。四、result 1Quantity testl用酶标仪进行比色，以用酶标仪进行比色，以0 ng/ml标准孔为空白孔，在波长标准孔为空白孔，在波长450nm处分别读取各标准孔和样本孔处分别读取各标准孔和样本孔OD值，以值，以OD值为横值为横坐标，坐标，AFP含量为纵坐标，在半对数坐标纸上画出标准曲含量为纵坐标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的线，以测定孔的OD值在标准曲线上查出相应标本的值在标准曲线上查出相应标本的AFP含含量。量。 2Quality testl在白色背景上直接肉眼观察结果。阴性对照孔应基本无色，在白色背景上直接肉眼观察结果。阴性对照孔应基本无色，阳性对照孔呈深蓝色。若待检样品孔色泽深于阳性对照孔阳性对照孔呈深蓝色。若待检样品孔色泽深于阳性对照孔则则AFP400ng/ml，阳性，阳性；若；若待检样品孔色泽深于阴性对照待检样品孔色泽深于阴性对照孔而浅于阳性对照孔则孔而浅于阳性对照孔则20ng/mlAFP400ng/ml，弱阳性，弱阳性；待检样品孔色泽浅于阴性对照孔则待检样品孔色泽浅于阴性对