赛拓实时荧光定量PCR讲座版

1、2022-2-222内容简介内容简介o 实时荧光定量PCR基本原理及应用 o 实时荧光定量PCR定量基础o 实时荧光定量PCR实验要素o 实时荧光定量PCR数据处理o 常见问题及解答2022-2-2232022-2-224 实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中引入荧光基团，利用荧光信号的变化实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线和CT值对未知模板进行定量分析的方法。是一种指数增长期定量的方法。什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量PCR？2022-2-225为什么要选择指数增长期定量？为什么要选择指数增长期定量？同一个模板96个重复梯度稀释的五个样品2022-2-226PCR分期分期202

2、2-2-227实时荧光定量实时荧光定量PCR两种常用方法两种常用方法染料法染料法 SYBR Green染料最常用。基本原理基本原理: 染料分子跟双链DNA特异性结合，染料分子与双链DNA结合前后荧光强度会发生10-100倍的改变。优点优点：价格便宜，使用方便。缺点缺点：特异性低。 探针法探针法 TaqMan探针和TaqMan MGB探针最成熟,另外还有LNA探针、分子信标、双杂交探针等等。TaqMan基本原理原理: 普通PCR加探针（5端连荧光基 团，3端连淬灭基团），Taq酶水解 探针，通过荧光信号积累检测PCR过程。优点：优点：灵敏度高，特异性好。缺点：缺点：需要探针，价格相对较贵。202

3、2-2-228MGB 探针探针更好的淬灭效果背景荧光低提高Tm值探针更短适于SNP分型2022-2-229TaqMan反应过程变性反应过程变性3553没有分子杂交2022-2-2210TaqMan反应过程反应过程退火退火3355模板和探针及引物杂交2022-2-2211TaqMan反应过程延伸反应过程延伸Taq酶将探针从5-3水解，开始产生荧光。ForwardPrimerReversePrimerQR33552022-2-2212实时荧光定量实时荧光定量PCR的应用的应用1.1.传染性疾病的定量分析传染性疾病的定量分析 病毒、细菌、衣原体、支原体定量检测 病情评估和药物疗效的观察和指导 2.2

4、.微小残留病变的检测微小残留病变的检测3.3.基因表达定量分析基因表达定量分析 不同组织基因表达的差异 处理（用药等）前后基因表达的改变 转基因表达分析 细胞因子的表达分析 肿瘤耐药基因表达的研究 4.SNP检测2022-2-22132022-2-2214PCR理论方程2022-2-2215荧光PCR信号方程2022-2-2216CT值与模板浓度的关系值与模板浓度的关系2022-2-2217Log(x) vs CTCT值跟起始模板浓度对数成反比2022-2-2218CT值由阈值确定值由阈值确定CT值值： C代表Cycle，T代表阈值(threshold)，CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号

5、到达设定的阈值时所经历的循环数。Threshold（阈值）2022-2-2219阈值由基线确定阈值由基线确定 阈值(threshold) 缺省值设定为基线（baseline）范围内荧光信号强度标准偏差的10倍。2022-2-2220典型扩增曲线2022-2-2222定量PCR实验要素o 未知样品 检测目的基因o 标准品 制作标准曲线o 阳性对照 监控试剂、系统o 阴性对照 监控试剂污染o 内对照（IPC） 数据之间可比性o 阳性参比荧光（ROX） 校正操作误差 o 重复样品 提高实验数据准确性2022-2-2223阳性内对照（阳性内对照（ IPC）的作用）的作用 实验一般以L为单位取样，由于D

6、NA或RNA抽提效率不同和操作误差，同样体积的DNA或RNA并不来源于同样数目的细胞。所以，copy/L要校正成copy/cell或copy/基因组才有比较意义。 选用管家基因作IPC，因为其在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数是相对恒定的，正比于细胞数或基因组数量，所以，其数量可以代表细胞数或基因组数量。 CopySmpl / CopyIPC 相当于 CopySmpl/ cell或CopySmpl/ 基因组，或者用CT = CT Smpl-CT IPC来表示。 2022-2-2224阳性参比荧光阳性参比荧光o 以固定的浓度存在于PCR Master Mix中，不参与扩增，信号强度只与取用多少

7、有关。 校正方式：Rn = RReporter/ RROXo 作用：消除用枪操作误差、管盖厚度等光学误差，减少孔间、批间差异，提高数据重现性和精确度。2022-2-2225 TaqMan数据的ROX校正效果2022-2-2227绝对定量和相对定量的定义绝对定量和相对定量的定义o 绝对定量绝对定量 目的是测定未知样品的准确拷贝数或浓度，需要已知准确拷贝数或浓度的标准品，需要制作标准曲线，数据处理比较方便，容易理解。o 相对定量相对定量 不需要测定未知样品的准确拷贝数或浓度，只需要知道样品之间的浓度比值。所以，标准品可以是已知准确拷贝数或浓度的标准品，但是，最常用的方法是通过稀释目的基因的PCR产

8、物作为标准品；标准品可有可无。数据处理相对复杂，比较难理解。2022-2-2228绝对定量数据处理举例绝对定量数据处理举例2022-2-2229标准曲线法相对定量举例标准曲线法相对定量举例2022-2-2230标准曲线法相对定量举例标准曲线法相对定量举例 目的基因(pg total RNA)目的基因的相对表达量（内参校正前） 内参(pg total RNA)目的经内参校正后的相对表达量相对于0小时时目的基因的表达量（内参校正后）0hr 1032 1 52,1522.0 x10-2 1 2hr 2320 2.25 45,1235.1x10-2 2.55 24hr 404 0.39 80,1760

9、.50 x10-2 0.252022-2-2231CT法相对定量举例法相对定量举例oCT的定义的定义 CT=（CT未知样品- CT未知样品内参）-（ CT基准样品- CT基准内参） 2022-2-2232比值与比值与CT的关系的关系 引入内参校正后 平均相对含量=2-平均CT2022-2-2233CT法举例法举例目的基因 平均CT 内参 平均CT内参校正. ( CT).与基准比较 (CT) 比值 2- (CT) 0Hr 24.5 12.6 11.9 0 1 2Hr 23.2 12.5 10.7 -1.2 2.324Hr 25.4 11.6 13.8 1.9 0.272022-2-2234202

10、2-2-2235问题一：定量问题一：定量PCR无扩增曲线无扩增曲线o可能原因一：可能原因一：DNA模板质量不好，含有抑制剂。模板质量不好，含有抑制剂。 解决办法：DMSO，SDS和甲酰胺等有机试剂会抑制Taq酶的活性。如果怀疑模板含有抑制剂，需要进一步纯化DNA，提高模板质量。o可能原因二：引物探针设计较差。可能原因二：引物探针设计较差。 解决办法：按照引物探针设计原则，重新设计并合成引物探针，对 探针序列进行blast比对，确保其特异性。 o可能原因三：引物探针合成质量较差。可能原因三：引物探针合成质量较差。 解决办法：用普通电泳法，观察是否有目的条带出现。确保探针荧 光报告基团和荧光淬灭基

11、团的存在，可以用DNase处理TaqMan 探针，检测荧光是否增强。必要的话重新合成引物探针。o可能原因四：模板浓度太低。可能原因四：模板浓度太低。 解决办法：浓缩模板，使模板浓度在104个拷贝左右，以便在25到 30个循环中获得CT值。2022-2-2236问题一：定量问题一：定量PCR无扩增曲线无扩增曲线o可能原因五：镁离子浓度太低。可能原因五：镁离子浓度太低。 解决办法：从3mM到10mM，进行一系列镁离子梯度反应，确定对于 每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。o可能原因六：引物浓度太低。可能原因六：引物浓度太低。 解决办法：为了精确测定引物浓度，测量OD260的数值，通过公式计算 浓度。

12、最佳引物浓度一般在0.1M和1.0M之间。o可能原因七：退火温度太高。可能原因七：退火温度太高。 解决办法：利用软件估算Tm值，降低退火温度，最好是进行退火温度 梯度实验，寻找最佳的退火温度。o可能原因八：反应体系中有不明物干扰。可能原因八：反应体系中有不明物干扰。 解决办法：对任何实验样品和试剂，应采用无菌无酶的离心管进行分 装、保存和使用。2022-2-2237问题二：阳性对照无扩增曲线 1. 确认对照 观察未知样品是否有扩增曲线，来判断是对照的问题还是体系的问题；有扩增曲线，说明是对照问题，否则，可能是体系问题。2. 确认体系 参考问题一的解决办法。 2022-2-2238问题三：阴性对照有扩增曲线o 可能原因一：模板被污染o 解决办法：隔离污染来源，更换试剂。使用UNG酶/dUTP防污染系统。使用专用