聚合酶链式反应 PCR

1、基因突变的类型（一）基因突变的类型（一）基因缺失基因缺失：地贫、地贫、DMDDMD或或BMDBMD、 变形性骨炎、无精症变形性骨炎、无精症诊断方法诊断方法：Southern blotSouthern blot，PCRPCR基因突变的类型（二）基因突变的类型（二）点突变点突变：HbMckees-RockHbMckees-Rock、HbHb Constant Constant Spring Spring、地中海贫血地中海贫血等。等。诊断方法诊断方法：RFLPRFLP、ASOASO杂交、杂交、PCRPCR产物多产物多 态性分析（态性分析（RFLPRFLP、SSCPSSCP、DGGEDGGE）印记基因

2、异常印记基因异常： 贝贝-威综合征（威综合征（Beckwith-Wiedemann syndrome）; 普普-威综合征威综合征（Prader-Willi syndrome）; 安格尔曼综合安格尔曼综合征（征（Angelman syndrome）诊断方法诊断方法：等位基因甲基化特异性：等位基因甲基化特异性PCR基因突变的类型（三）基因突变的类型（三）基因异常不明基因异常不明 ：成年型多囊肾病等：成年型多囊肾病等. .诊断方法诊断方法：连锁的多态性，如：连锁的多态性，如SSCPSSCP、AFLPAFLP连锁分析，连锁分析，RFLPRFLP位点单体型连锁位点单体型连锁分析分析. .基因突变的类型（

3、四）基因突变的类型（四） 出生缺陷预防实验室诊断方法第三章第三章 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 概念：概念：利用利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，片段旁侧两个短的单链引物，在热稳定的聚合酶作用下，通过双链在热稳定的聚合酶作用下，通过双链DNA模板的热模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，体外快速变性、引物退火和引物延伸的重复循环，体外快速扩增特异扩增特异DNA片段的技术。该技术由片段的技术。该技术由Kary Mullis发发明，并获明，并获1993年度诺贝尔奖。年度诺贝尔奖。（Chapter 2 Polymerase Chain Reaction，PCR）1.PCR1.PCR原理和方法

4、原理和方法 PCR即是在体外模拟即是在体外模拟DNA复制的过程，它用复制的过程，它用加热的办法让所研究的加热的办法让所研究的DNA片段变性变成两条单片段变性变成两条单链，人工合成两个引物让它们结合到链，人工合成两个引物让它们结合到DNA模板的模板的两端，两端，DNA聚合酶即可以大量复制该模板。聚合酶即可以大量复制该模板。假定我们要研究的假定我们要研究的DNADNA双链两端的序列是：双链两端的序列是：TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTTATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA使

5、用材料：使用材料：引物引物F: ataagcccgaaaggttcgtt引物引物R: tttacggatcggcaacctatDNA模板模板DNA聚合酶（聚合酶（Taq）底物（四种脱氧核苷）底物（四种脱氧核苷）55334.PCR4.PCR的的PBDPBD中的应用中的应用 建立于建立于PCRPCR技术基础上的突变基因检测技术发技术基础上的突变基因检测技术发展迅速，它不仅能在短时间内检出发生突变的基因，展迅速，它不仅能在短时间内检出发生突变的基因，而且即使获得极微量的组织亦可经而且即使获得极微量的组织亦可经PCRPCR扩增而进行扩增而进行各种检测，加上各种检测，加上PCRPCR技术与分子杂交、技术

6、与分子杂交、SSCPSSCP、DDGGEDDGGE、RFLPRFLP及直接测序等技术的结合，大大的促进了出生及直接测序等技术的结合，大大的促进了出生缺陷预防（缺陷预防（Prevention of birth defectsPrevention of birth defects，PBDPBD）的研究。的研究。（1） Gap-PCR 应用条件：应用条件：基因的基因的DNA序列已经清序列已经清楚，其楚，其缺失缺失部位亦较为固定。部位亦较为固定。举例举例1，-地贫：地贫：中国人中常见的缺失型中国人中常见的缺失型地贫基因为地贫基因为-SEA、-3.7和和-4.2 。 2 1 2 1 2 1-SEA-3.

7、7-4.253 2 1 2 1 2 153 U M D D U-SEA53 2 1 2 2 1 2 1 2 1-SEA-3.7-4.253P1P2P3P4(2) (2) 等位基因特性等位基因特性PCRPCR（allele-specific pcr,ASPCR）应用条件：应用条件：基因的基因的DNA序列已经清序列已经清楚，其突变性质为楚，其突变性质为点突变点突变。ASPCR:也称为扩增阻碍突变系统也称为扩增阻碍突变系统 (amplification refractory mutation system,ARMS)ASPCR原理：原理： PCR反应中反应中DNA合成是根据碱基互补原则来获合成是根据

8、碱基互补原则来获得相同的得相同的DNA片段的，有时引物与模板的单个碱片段的，有时引物与模板的单个碱基存在差异时，多聚酶链反应仍能进行，但当基存在差异时，多聚酶链反应仍能进行，但当3末末端两个并列碱基其中之一与模板不互补端两个并列碱基其中之一与模板不互补(错配错配)时，时，PCR就会因磷脂键形成困难而受阻则无反应发生。就会因磷脂键形成困难而受阻则无反应发生。ASPCRASPCR引物设计引物设计： 通过设计两个通过设计两个5端引物，一个与正常端引物，一个与正常DNA互补，互补，一个与突变一个与突变DNA 互补，对于纯合型突变，分别加互补，对于纯合型突变，分别加入这两种引物及入这两种引物及3端引物进

9、行两个平行端引物进行两个平行PCR，只有，只有与突变与突变DNA 完互补的引物才可延伸并得到完互补的引物才可延伸并得到PCR 扩扩增产物。如果错配位于引物的增产物。如果错配位于引物的3端第一或第二个碱端第一或第二个碱基，则导致基，则导致PCR 不能延伸。不能延伸。M 1 2 3 455353335（signle strand conformation polymorphism,SSCP） （3 3）单链构象多态性）单链构象多态性 概念概念：单链单链DNADNA由于碱基序列的不同可引由于碱基序列的不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链的单链

10、DNADNA电泳迁移率不同，从而可用于电泳迁移率不同，从而可用于DNADNA中单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。中单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。 应用条件：应用条件：单碱基替代、微小缺失或插入。单碱基替代、微小缺失或插入。可检测未知突变。需测序确认突变。可检测未知突变。需测序确认突变。PCR-SSCP分析法适用于致病基因内尚未明确的点突变，可将检测范围缩小至某一外显子或某一片段，再对外显子或片段进行测序即可确定突变位点。解链构像DAN原原 理理1 2 3 4 5过过 程程 实例实例1 1镰镰 型型 细细 胞胞 贫贫 血血 症症实例实例2 2 多发性错构瘤综合征多发性错构瘤综合征

11、 Cowden Syndrome CowdenCowden综合征（综合征（CSCS）是一种常染色体显性遗传病，）是一种常染色体显性遗传病，特征是形成多发性错构瘤，累及所有源自特征是形成多发性错构瘤，累及所有源自3 3个胚层的器官。个胚层的器官。合并合并CowdenCowden综合征的经典错构瘤是毛鞘瘤。患病的家族综合征的经典错构瘤是毛鞘瘤。患病的家族成员具有发展成乳腺癌和非髓性甲状腺癌的高级别危险。成员具有发展成乳腺癌和非髓性甲状腺癌的高级别危险。临床表现还包括黏膜上皮病变、甲状腺异常、乳腺纤维临床表现还包括黏膜上皮病变、甲状腺异常、乳腺纤维囊性病变、胃肠道错构瘤、早年就发病的子宫平滑肌瘤、囊

12、性病变、胃肠道错构瘤、早年就发病的子宫平滑肌瘤、大头畸形、智力低下以及小脑发育不良性神经节细胞瘤大头畸形、智力低下以及小脑发育不良性神经节细胞瘤（LhermitteLhermitteDuclosDuclos）。该综合征是由）。该综合征是由PTEN/MMAC1PTEN/MMAC1基因基因突变引起的。突变引起的。PTEN 外显子外显子5 (R130X)新发点突变新发点突变. PTEN 外显子外显子7 (Q214X) 点突变点突变 ( Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE) (4) (4) 变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳 原理：原理：电泳开始时电

13、泳开始时,DNA,DNA在胶中的迁移速率仅与在胶中的迁移速率仅与分子大小有关分子大小有关, , 而一旦而一旦DNADNA泳动到某一点时泳动到某一点时, , 即即到达该到达该DNADNA变性浓度位置时变性浓度位置时, , 使得使得DNADNA双链开始分双链开始分开开, ,从而大大降低了迁移速率。由于不同的从而大大降低了迁移速率。由于不同的DNA DNA 片段的碱基组成有差异片段的碱基组成有差异, , 使得其变性条件产生差使得其变性条件产生差异异, , 从而在凝胶上形成不同的条带。从而在凝胶上形成不同的条带。应用条件：应用条件：与与PCR-SSCP相似相似DGGE原理图原理图恒定变性凝胶电泳(CD

14、GE)瞬时温度梯度电泳(TTGE)温度梯度凝胶电泳(TGGE)此外类似的实验方法还有：(5) (5) 限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）概念：概念：当基因突变涉及到限制酶识别位当基因突变涉及到限制酶识别位点时，限制性内切酶可将点时，限制性内切酶可将DNADNA切成长度切成长度不同的片段，从而在人群中形成多种类不同的片段，从而在人群中形成多种类型故称为限制性片段长度多态性。型故称为限制性片段长度多态性。 应用条件：应用条件：当基因突变涉及到限制酶识当基因突变涉及到限制酶识别位点时。别位点时。Al

15、lele IIAllele II12Kb8Kb4Kbprobeprobe12Kb8Kb RFLPRFLPSouthern blotSouthern blot检测结果检测结果 实例1 实例 2 长 QT间期综合征 LQTS多数由单多数由单个氨基酸置换引个氨基酸置换引起，本系谱显示起，本系谱显示的是的是HERG 基因基因371 位置位置TC 置置换换,PCR产物采用产物采用AccII酶解后酶解后,产产生生138 bp 片断。片断。(methylation specofic PCR, MS-PCR)(6)(6) 甲基化特性甲基化特性PCR孟德尔定律不能解释的遗传现象：孟德尔定律不能解释的遗传现象：某

16、个子女的一个特征长得像父亲而某个子女的一个特征长得像父亲而 另一个子女的同一特征则长得像其母，另一个子女的同一特征则长得像其母， 而不是表现父母同一性状的平均值。而不是表现父母同一性状的平均值。公驴和母马所产后代称为马骡（公驴和母马所产后代称为马骡（mule）；）； 公马和母驴所产后代称为驴骡（公马和母驴所产后代称为驴骡（hinny）。）。基因组印记基因组印记(genomic imprinting)(genomic imprinting)：又称遗传印：又称遗传印记。在哺乳类动物、低等动物和植物中，有些基记。在哺乳类动物、低等动物和植物中，有些基因不是对等表达，而是只选择性地表达来源于父因不是对

17、等表达，而是只选择性地表达来源于父或母一方基因。这种现象称为基因组印记。或母一方基因。这种现象称为基因组印记。印记基因：印记基因：受到印记控制的基因称为印记基因。受到印记控制的基因称为印记基因。印记基因的功能：印记基因的功能：印记的基因只占人类基印记的基因只占人类基因组中的少数，可能不超过因组中的少数，可能不超过5%5%，但在胎儿，但在胎儿的生长和行为发育中起着至关重要的作用。的生长和行为发育中起着至关重要的作用。基因组印记病主要表现为过度生长、生长基因组印记病主要表现为过度生长、生长迟缓、智力障碍、行为异常。迟缓、智力障碍、行为异常。遗传印记的发现遗传印记的发现 19811981年年Catt

18、anachCattanach等发现具有两条等发现具有两条母源的母源的1111号染色体的小鼠在胚胎期要号染色体的小鼠在胚胎期要比正常小鼠小比正常小鼠小, ,而具有两条父源的第而具有两条父源的第1111号染色体的小鼠在胚胎期比正常小号染色体的小鼠在胚胎期比正常小鼠大。这两种小鼠虽然能进行胚胎发鼠大。这两种小鼠虽然能进行胚胎发育育, ,但是均死于胚胎发育阶段。但是均死于胚胎发育阶段。 1984年年McCrath等人用人工单性繁等人用人工单性繁殖殖(孤雌或孤雄生殖孤雌或孤雄生殖)的方法产生了两种的方法产生了两种特殊类型的小鼠胚胎，即一种小鼠胚胎特殊类型的小鼠胚胎，即一种小鼠胚胎的全套染色体来自父源，另

19、一种小鼠胚的全套染色体来自父源，另一种小鼠胚胎的全套染色体来自母源。这两类小鼠胎的全套染色体来自母源。这两类小鼠均在发育期死亡。均在发育期死亡。 1991 1991年年DechiaraDechiara等人通过基因剔除技等人通过基因剔除技术破坏小鼠胰岛素样生长因子术破坏小鼠胰岛素样生长因子IGF2IGF2基因发基因发现了第现了第1 1个内源性印记基因。若被剔除的个内源性印记基因。若被剔除的等位基因源于父本，则动物表现为侏儒。等位基因源于父本，则动物表现为侏儒。相反如为母源则无特殊表型，这些本身剔相反如为母源则无特殊表型，这些本身剔除了等位基因的雌鼠，其子代大小正常。除了等位基因的雌鼠，其子代大小

20、正常。实验表明实验表明IGF2IGF2被印记而且仅父源等位基因被印记而且仅父源等位基因正常表达。正常表达。印记的过程印记的过程印记形成印记形成印记维持印记维持印记去除印记去除差异差异DNADNA甲基化甲基化 Differential DNA methylation染色质重塑染色质重塑 Chromatin remodeling非编码非编码RNARNA Non coding RNA基因印记产生的机制基因印记产生的机制：差异甲基化差异甲基化lthe promoter for IGF2r transcription is methylated (and inactive), lbut the down

21、stream promoter is unmethylated and active. lTranscription of the antisense strand from the downstream promoter produces an ansense RNA that may participate in shutting his gene down. Significant DNA methylation changes are indicated as thick red and green blocks in the ideograms. The 50-year-old tw

22、in pair shows abundant changes in the pattern of DNA methylation (green=hypermethylation and red=hypomethylation), 3-year-old twins have a very similar DNA methylation (yellow). 染色质重塑染色质重塑Acetylation and deacetylation 非编码非编码RNARNAlthe promoter for IGF2r transcription is methylated (and inactive), lb

23、ut the downstream promoter is unmethylated and active. lTranscription of the antisense strand from the downstream promoter produces an ansense RNA that may participate in shutting his gene down. (1)(1) 呈簇排列呈簇排列印记基因的特点：(2) 都有一个或几个印记中心都有一个或几个印记中心(IC)，即差，即差 异甲基化区异甲基化区(DMR)(3) DMR内，有富含内，有富含CpG的的CpG岛岛(4)

24、 基因印记可以逆转的基因印记可以逆转的Beckwith-Wiedemann syndrome, BWSPrader-Willi syndromeAngelman syndrome印记基因异常导致的疾病印记基因异常导致的疾病 症状巨大舌、脐膨出和生长过剩是BWS的3大主要特征，其它的特征还有出生时的低血糖、内脏肿大(主要为肝、肾、脾的肿大)、单侧肥大(身体的一侧生长过剩) 耳垂的线状凹陷、肾上腺皮质细胞肿大和肾髓质生长异常等等。约30%的患儿伴有出生时低血糖，可致神经障碍。随着年龄的增长症状变得不明显，致年长儿和成人的诊断困难。另外，约10% BWS患者伴胎儿性肿瘤，其中5O-60% 为Wilm

25、s瘤。 15% 为肾上腺肿瘤其它还有肾母细胞癌、肝母细胞瘤等。BWS临床症状 发病率约发病率约0.07 0.07 ，无性别差异，无性别差异，85%85%为为散在发病，散在发病，l5%l5%为家族性遗传，符合常染色体为家族性遗传，符合常染色体显性遗传。同一家族内患者的临床表现差异显性遗传。同一家族内患者的临床表现差异很大。家族性遗传为母亲单侧遗传，显示其很大。家族性遗传为母亲单侧遗传，显示其发病与基因组印记有关。发病与基因组印记有关。遗传特点：遗传特点：病因学细胞遗传学水平：在散在发病患者，有llp15重复或双体型、三体型、平衡易位和倒位等染色体异常的报道，其中11p15的重复和三体型的多余部分

26、均来自父亲，11p15附近有切断点的平衡易位和倒位等均来自母亲。基因水平：BWS基因存在区域11p15.5，。迄今为止在这个基因组区已克隆了10多个印记基因和非印记基因。BWS和这个区域的印记基因p57变异、IGF2H19转录异常、染色体易位(倒位)及LIT1基因上游CpG岛的甲基化有关。Prader-Willi/ /Angelman综合征综合征 PWS(MIM176270)的特点为：胎动减少，的特点为：胎动减少，肥胖，婴儿期肌张力减退，智力障碍，身材短肥胖，婴儿期肌张力减退，智力障碍，身材短小，促性腺激素分泌不足的性腺机能减退和手小，促性腺激素分泌不足的性腺机能减退和手足异常。足异常。 PW

27、S和和AS是两种临床上明显不同的神经是两种临床上明显不同的神经遗传性疾病。遗传性疾病。鬓角鼻梁窄杏仁型眼睛/轻度斜视上唇薄/下唇上抿超重 AS(MIM105830)的特点是严重运动、智力障的特点是严重运动、智力障碍，共济失调，肌张力低下，癫痫，语言障碍和以碍，共济失调，肌张力低下，癫痫，语言障碍和以巨大下颌及张口吐舌为特征的特殊面容。巨大下颌及张口吐舌为特征的特殊面容。Bower和和Jeavons于于1967年创造了名为愉快木偶综合征年创造了名为愉快木偶综合征(AS)的疾病，称的疾病，称“安琪儿安琪儿”(Angelman)。PWS和和AS均均为染色体为染色体15q11-13缺陷，其发病率约为缺

28、陷，其发病率约为1/15 000 。PWS和和AS的分子缺陷类别的分子缺陷类别（1）缺失）缺失约70%的PWS及AS患者均发现有染色体15q11-13的缺失。PWS为父源染色体15q11-13的缺失、母源基因不表达，而AS为其母源染色体15q11-13的缺失、父源基因不表达。（2）单亲二体）单亲二体(uniparental disomy, UPD) PWS和AS患者的两条15号染色体均正常，但PWS患者的两条15号染色体均来自母亲，即母亲单亲二体(UPD)；而AS患者的两条15号染色体均来自父亲，即父亲单亲二体(UPD)。PWS的UPD发生率较普遍(25%)，而AS的较低(2%)。 （3）印迹

29、突变 世代传递过程中，由于控制印迹的基因发生突变导致在世代传递过程中，由于控制印迹的基因发生突变导致在配子形成中发生重新设定和转换失败。约配子形成中发生重新设定和转换失败。约5%的的PWS和和AS患患者虽然从双亲各遗传了者虽然从双亲各遗传了1条条15号染色体，但是它们在印迹的号染色体，但是它们在印迹的染色体染色体15q11-13区域呈现异常区域呈现异常DNA的甲基化和基因表达，提的甲基化和基因表达，提示这类患者在自身的印迹过程中发生了突变。其中的一半示这类患者在自身的印迹过程中发生了突变。其中的一半(包括家族性的包括家族性的)为微缺失，为微缺失，PWS缺失的共同最小区域在缺失的共同最小区域在SNRPN基因的第基因的第1外显子外显子(4kb)，而，而AS在在SNRPN基因的第基因的第1外显子的上游外显子的上游(2kb)，从而确定这类患者为印迹中心，从而确定这类患者为印迹中心