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文档简介

1、.1PCR引物设计方法和原理 .2一、引物设计的目的一、引物设计的目的n获得目标片段获得目标片段nDNA测序测序n基因克隆基因克隆n体外转录体外转录n突变突变n探针设计探针设计n分子标记分子标记.3二、引物设计的类型二、引物设计的类型n常规常规PCR引物引物nPCR同源引物和简并引物同源引物和简并引物n探针探针.4引物设计的步骤引物设计的步骤n下载下载DNA模板或蛋白质序列模板或蛋白质序列n进行同源比较，找到保守同源序列进行同源比较，找到保守同源序列n设计引物设计引物.5四、四、PCR引物设计的原则引物设计的原则n引物长度（primer length）: 18-27 bp n GC钳(GC c

2、lamp: 引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加n3末端碱基（3End Sequence）: n Tm 值(melting temperature) ：5260 nGC 含量（composition） ：40-60% .6四、四、PCR引物设计的原则引物设计的原则nG 值是指DNA 双链形成所需的自由能(internal stability, 用G 值反映) :选用3端G 值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G 值相对较高的引物 n引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值 :超过

3、4.5kcal/mol易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行n引物的修饰 :一般是在5端增加酶切位点 .7Breslauer,邻近法的相邻核苷酸的动力学数值(自由能)来预测双链稳定性 .8五、简并引物的设计五、简并引物的设计.9五、同源引物设计 .10六、网络免费在线引物设计软件六、网络免费在线引物设计软件.11六、引物设计常用商业软件包六、引物设计常用商业软件包.12七、Primer Premier和和Oligo引物软件引物软件使用方法使用方法n常有引物设计软件的引物的自动搜索和评价分析常有引物设计软件的引物的自动搜索和评价分析 软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以“Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“Vector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Pr

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