3T3L1细胞实验操作

1、3T3-L1细胞实验操作3T3-L1 小鼠胚胎成纤维细胞（前脂肪）培养基配制 （准备1L高压过的超纯水） 1、DMEM粉倒入1L放旋子的烧杯，加灭菌水1000ml，盖锡纸磁力搅拌40分钟。2、擦净，加入3.7g Na2CO3，盖锡纸磁力搅拌10分钟。3、称2.38g HEPES（4保存），盖锡纸磁力搅拌20分钟。4、拿过滤嘴、针筒，用针筒吸配好的培养基，通过滤嘴过滤至高压过的100ml瓶分装，4保存，用时加10ml血清配成10%FBS。顺便先配诱导液：配好的培养基分装入100ml瓶中，90mlDMEM。准备好FBS、IBMX、DEX、insulin（2g/ml）先配两瓶100ml 10%FBS

2、，A液：IBMX 1ml + DEX 100l + insulin 250l 入 100ml 10%FBS B液：insulin 250l 入100ml 10%FBS （先过滤）细胞冻存 （全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）1、准备 DMEM（分装好的）* 1瓶，50 ml瓶 * 2，针，过滤器 * 1，DMSO试剂，冻存管。2、配冻存液（10ml）：按5：4：1比例 培养基 5ml ：血清 4ml ：DMSO 1ml ，混匀。3、 拿出一个新的、标记好用 针筒 把 过滤器 弄在 瓶口 用 针筒 吸 新配的冻存液，把针头 摘掉，经 过滤器 把 新配的冻存液 滤到新瓶。4、 PBS清洗细

3、胞，加完盖盖子，加在壁上，然后吸弃，换枪头吸（一对一）。5、 吸 胰酶500l（吸匀再用），放显微镜观察，消化完毕即吸弃（一对一）。6、 大皿加入23ml冻存液，打圈吹散，分装1ml至冻存管，勿离心。7、 -4 30min，-20 1h，-80 2h，最后液氮冻存。一、细胞复苏 （准备10%FBS、晚上复苏）1、 将从液氮取出冻存管放入37恒温水箱搅拌解冻。2、 将细胞悬液软管吸取至培养皿中，加入56 ml10%FBS，混匀。3、 培养过夜后进行换液。二、细胞传代 （全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）10%FBS 即 90mlDMEM + 10ml血清 半个月内用完1、缓慢吸走旧培养基

4、，换枪头，用2ml DMEM清洗，后吸弃。2、加500l胰酶，在显微镜观察细胞形态，大部分消化成方形即可吸弃胰酶。3、加入2ml10%FBS，打圈混匀，吸1ml，每皿大概56滴入新的培养皿（大皿10滴1ml），其余弃掉，后加3ml10%FBS（大皿8ml），大概可2天传代。4、换液时需缓慢吸弃旧培养基，DMEM清洗细胞（注意换枪头杜绝污染）后吸弃，10%FBS贴壁加入3ml。三、细胞接板 （全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）24孔板：560l 细胞+6ml 10%FBS （12个样） 【600l 分化 1.2ml 增殖】12孔板：1400l细胞+11ml 10%FBS用25ml瓶一板对

5、一瓶装1、 准备好12孔板、24孔板各两份（两皿细胞）、DMEM、血清、25ml瓶4个、软管。2、 配10%FBS 90ml DMEM+10ml 血清3、 第一二瓶 各6ml 10%FBS，第三四瓶 各11ml 10%FBS4、 吸弃旧培养基，加2ml DMEM摇晃清洗，吸弃，500l一皿细胞胰酶消化，显微镜观察细胞分散开来即停止消化。5、 每皿加入2ml 10%FBS，1ml枪头打圈吹散。6、 将两皿细胞集中在一个培养皿，打圈吹散。7、 560l细胞分别加入一二瓶混匀，1400l细胞分别加入三四瓶混匀。8、 一二瓶对应加500l细胞进24孔板（加12个孔）摇晃混匀， 三四瓶对应加1ml细胞进

6、12孔板，摇晃混匀。放培养箱，第二天进行转染。四、细胞转染 （无酶EP管、无酶小管、全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）1、准Opti-MEM ，灭菌水，mic（inhibitor），NC，Lipo3000，无酶EP管、无酶小管，96孔枪头板，12孔板、24孔板各2板（工具照紫外）2、NC、mic（inhibitor）4 1500r 1.5min离心3、分装Lipo3000 tube管150l一管（轻混），mic（inhibitor）、 NC 小管（换枪头加灭菌水稀释，按说明书要求），标记好4、分装Opti-MEM 20ml入瓶待用5、计算好体系：(n为样品数量，N为总样品数量）Mic：

7、45l + 600l Opti-MEM （12孔板）- 3.75 l Mic * n + 50lOpti-MEM * n；22.5l + 300l Opti-MEM （24孔板12个样）-1.875l Mic * n + 25lOpti-MEM * n NC：45l + 600l Opti-MEM （12孔板）- 3.75 l NC * n + 50lOpti-MEM * n；22.5l + 300l Opti-MEM （24孔板12个样）-1.875l NC * n + 25lOpti-MEM * nLP：84l + 1200l Opti-MEM （12孔板）- 3.5 l LP * N +

8、 50lOpti-MEM * N ；36l + 600l Opti-MEM （24孔板12个样）-1.5l LP * N + 25lOpti-MEM * N Inhibitor：90l + 600l Opti-MEM （12孔板）- 7.5 l inh * n + 50lOpti-MEM * n；45l + 300l Opti-MEM （24孔板12个样）- 3.75 l inh * n + 50lOpti-MEM * nNC：90l + 600l Opti-MEM （12孔板）- 7.5 l NC * n + 50lOpti-MEM * n；45l + 300l Opti-MEM （24孔板

9、12个样）- 3.75 l NC * n + 50lOpti-MEM * nLP：84l + 1200l Opti-MEM （12孔板）- 3.5 l LP * N + 50lOpti-MEM * N ；36l + 600l Opti-MEM （24孔板12个样）-1.5l LP * N + 25lOpti-MEM * N 6、标记好tube管：mic 45l + 600l ；mic 22.5l + 300l；NC 45l + 600l；NC 22.5l + 300l；LP 84l + 1200l；LP 36l + 600l。in 90l + 600l ；in 45l + 300l；NC 90

10、l + 600l；NC 45l + 300l；LP 84l + 1200l；LP 36l + 600l。注意：LP 需轻轻混匀，平均分至；平均分至，加后轻轻混匀。静置5min，拿出接板后的12孔板、24孔板细胞观察。7、 将旧培养基吸弃，12孔板 每孔1ml Opti-MEM + 100l转染液；24孔板 每孔 500l Opti-MEM + 50l 转染液（12个孔）8、加完晃匀，6h后换10%FBS，放培养箱42h后换诱导液开始进行诱导。五、细胞诱导分化 （全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）配置储备液：IBMX(异丁基-甲基-黄嘌呤): 分子量：222.2g/mol（Sigma:I

11、5879）-20保存（难溶最后溶） 用二甲基亚砜DMSO配制111.1mg/ml（0.5mol/L）储存液 即：0.0115g IBMX + 940 ul ddH2O + 60 ul KOH需用滤嘴过滤至新瓶子 终浓度为0.5mmol/L。（现配现用）DEX： 分子量：392.5g/mol（Sigma:D4902）-20保存用无水乙醇配制1mg/ml(2.5mmol/L)储存液 即： 0.2mg DEX + 0.5ml 无水乙醇 终浓度为1umol/L。Insulin：25mg Insulin + 12.5ml HCl溶解后过滤，PCR小管分装， 终浓度为2ug/ml，-20保存。1、待3T3

12、-L1细胞在24孔板，毎板100l原细胞体积+400l 10% FBS 养2天长满，配制 诱导液 诱导3T3-L1分化。（先配好10%FBS两瓶100ml的）2、将旧培养液软管吸弃，PBS清洗，吸弃PBS，加入配制好的诱导液I 每孔500l于24孔板中，培养2天。3、将培养液软管吸弃，PBS清洗，吸弃PBS，用200ul的枪头慢慢加入配制好的诱导液II 每孔500l于24孔板中，培养2天。4、将旧培养液软管吸弃，PBS清洗，吸弃PBS，用10%FBS培养基培养2天。5、细胞油红O染色的操作步骤：、10%中性甲醛的配制材料：中性甲醛(多聚甲醛) 密封瓶。方法：称取1g中性甲醛粉末，加入

13、10ml的超纯水中，密封，在60度水浴中过夜才能溶解。配好的溶液1个星期内有效，最好4度保存。、染色液的配制材料：油红染料、棕色可密封瓶、异丙醇、针筒、滤嘴方法：称取预先研磨粉碎的0.5g油红干粉，溶于少量异丙醇中，然后加异丙醇至100ml，60水浴溶解，棕色瓶密封(或锡箔纸包裹避光)4保存，为储存液，可长期保存。用时取6ml加超纯水4ml混匀，滤嘴过滤，稀释后数小时内用完。1、 吸弃培养基，用PBS洗2遍，加入10的甲醛固定30min1h（贴壁加），期间过滤油红2、 吸弃10%甲醛，用超纯水洗2遍，60%异丙醇孵育5min3、 吸弃60%异丙醇，均匀覆盖oil red O染20min（6孔板

14、 2ml，12孔板 1ml，24孔板 500l）4、 吸弃oil red O 后，用超纯水洗25遍，直至无污点5、 加苏木精孵育细胞1min，吸弃苏木精，超纯水25遍6、 在细胞上加超纯水观察若转染诱导成功，重新转染诱导一批细胞，进行一系列实验：流式细胞术： （无酶枪头、1.5mltube管）注意用前灭菌1、 准备接板好的12孔板细胞、无酶枪头、tube管、96孔板。2、 摆好12个tube管，把原来1ml 10%FBS培养基吸至tube管，一组一枪头，吸1ml PBS清洗细胞（悬空加）。吸弃 PBS，一组一枪头，吸100150l胰酶消化细胞（两排两排消化），显微镜观察第一个，吸弃胰酶，将原培

15、养基从tube管一一对应吸回去12孔板，并吹匀细胞，轻轻吹打。显微镜观察是否吹匀。3、 将消化并吹匀的细胞悬液吸回去tube管，一对一，3000g 离心5min。4、 吸上清，留沉淀，大概留50l，调950l吸弃上清。5、 悬空加入4冷却的PBS 1ml，吹匀细胞，3000g 离心5min，吸弃PBS（950l+50l两次 小心吸弃）。6、 加300l4冷却的PBS，吹匀细胞，避免成团。7、 缓慢悬空加入700l预冷的70%无水乙醇，轻轻吹打均匀，4保存（可一周）。PI染色：1、 准备好染色剂、25ml用锡箔纸包好的小瓶、24孔板、锡箔纸。 算好体系，多配一个样，加入小瓶备用。现配现用，当天使

16、用，4保存： 染色缓冲液 （n+1）* 0.5 ml-20 碘化丙啶染色液（20x） （n+1）* 25 l 保存 RNase A （50x） （n+1）* 10 l 避光配制 Total （n+1）* 0.535 ml 先加多后加少 容易混匀2、 将样品 5000g 离心 6 min，沉淀细胞。小心吸除上清，850l+50l吸弃上清，预留50l左右的乙醇，以免吸走细胞。3、 加入4 PBS，洗涤一次，离心5000g 5 min，沉淀细胞，小心吸除上清，850l+50l吸弃上清，预留50l左右的PBS，以免吸走细胞。4、 轻轻弹击tube管底，使细胞分散，避免成团。5、 染色：每管样品中加入0

17、.535 ml 染色液，缓慢并充分重悬细胞，37避光（样品放入24孔板用锡箔纸包好）温浴（放烘箱）30min，随后4或冰浴避光（样品垂直插入携带冰箱内冰）存放。染色完成后宜24h内或当日完成检测，最好当天完成。CV变异系数 CV越低，峰值越好，越尖锐，5% 左右效果较好，一般10%即可。提RNA的收样 （无酶枪头、1.5mltube管）注意用前灭菌一组组分好不同枪头吸弃培养基，加入500l RNAiso 放5min。标记好无酶1.5mltube管，反复刮取、吸取细胞，将细胞移至tube管（不同组必须换枪头，移完盖好）。收样存放-80。RNA提取 （无酶枪头、1.5mltube管）从-80冰箱取

18、出样品 静置5min 后12000r，4 离心10min上清移至新的1.5ml tube管并标记好 加入 RNAiso Plus等体积的 氯仿 （一般为100l） 震荡摇匀室温静置 5min 12000r，4 离心15min将上清转移至新的tube管并标记好 （150200l） 加与上清液 等体积的 异丙醇，颠倒混匀 室温静置10min 13000r，4 离心10min弃上清，向沉淀加入1ml的75%乙醇颠倒清洗沉淀（离心时以管头朝内侧，则沉淀会附于管外侧，加入乙醇时从内侧，勿触沉淀，设阴性对照，即横板为dH2O） 13000r，4 离心10min弃上清，留沉淀 14000r，4 离心3min

19、吸走多余的75%乙醇 操作台风干 2min各加入8l DEPC溶解检测纯度：打开软件按“Acid”按“否”选RNA 每次吸 2l DEPC 先洗3遍，用滤纸弄干用2l DEPC 每洗1次按Blank ，Measure 洗到 0.5 为止每个样品吸2l，Measure（每测完一次都要擦干） 保存（Report）RNA稀释： （mRNA定量 C统一为200 miRNA定量C统一为500） （ V剩 = 6l）miRNA 定量 （冰上操作、无酶离心管、无酶枪头）取已稀释的RT引物5l，加入45l RNA-Free水。准备好96孔板，引物RT，U6RT，放在冰上。多配一个体系：miRNA-RT引物 2

20、l（n+1）U6 RT 2l（n+1） RNA 不少于1500ng（1500ng/C统一=3l）无菌ddH2O 4 l（n+1）总体积 11l（n+1）注意：RT引物用前稀释；配体系时，RT引物和U6RT的量是固定的，模板和水的量是浮动的；只在一个引物里面加内参；下游引物是通用的；不够的体系用无菌ddH2O配平；做完样品后保存至-20；如果接下来要做miRNA定量，则放在4备用。样品1样品2样品3样品4样品5样品611l体系11l体系11l体系11l体系11l体系11l体系后对应加入模板（1500ng/C统一=）3l ，标记好，放入小型离心机，离心一下，再放入PCR仪70 10min，冰上2m

21、in（程序：000）放一管无酶tube管，多配一个体系，加入体系：5 x buffer 5l（n+1）Mix 1l（n+1）无菌ddH2O 8l（n+1）总体积：14l（n+1）样品1样品2样品3样品4样品5样品614l体系14l体系14l体系14l体系14l体系14l体系即总体积：25l42 1h，37 15min，98 5min（程序：0000）多配一个体系（n+1），混匀，引物瞬时离心：SYBR 10l（n+1）F 0.8l（n+1）R（通用） 0.8l（n+1）ddH2O 6.4l（n+1）除去模板2l，总体积18l（n+1）在冰上铺一次性手套，按96孔板在冰里，放好定量小管，标记好每

22、个小管对应加18l体系，每个样都要有U6作为参照：cDNA123456miRmiR体系miR体系miR体系miR体系miR体系miR体系U6U6体系U6体系U6体系U6体系U6体系U6体系盖上盖子，注意勿污染，用一次性手套隔着按紧定量管盖子，用镊子轻轻撬松定量小管，离心一下。去杨老师那，打开Real-time机，桌面miRNA pcrd，然后OKNext选第三个Open Lid，放样品，用一次性手套按一下，最后Close LidStar Run，选择文件夹命名好保存，直到机器绿灯亮起，登记好走人。RT-PCR （冰上操作、无酶离心管、无酶枪头）按1：50 比例 加1l gDNA Remover

23、 入 50l 4 x DNA master mix标记、加样、低速离心，加2lRNA进管，RNA热变性 5min 65，冰上冷却 先配总 4 x DNA master mix 2l（固定） 后分装 dH2O 4l（根据样品而定） C统一为200 RNA模板（样品） 2l（0.5g） Total 8l 37 5min 冰上冷却 注：n为样品数量 上述反应液 8l 5xRTmixII 2l Total 10l37 15min，50 5min，98 5min，4 保存加 ddH2O稀释40l - 即稀释5倍（换枪头混匀，4保存）mRNA定量 （冰上操作、无酶离心管、无酶枪头）1、反应体系试剂体积&#

24、215;10 L 上游引物0.8 L下游引物0.8 L灭菌水5.4 LRNA模板3 L总体积20L(n+2)*10 (避光) 各（n+2）* 0.8体系(n+2) * 5.42、 冰上操作，准备好各种规格的无酶枪头、tube管、引物、定量管3、 计算体系，多配2个4、 摆好定量管、tube管，标记好，先加体系（加中间，勿碰壁）5、 加样 一个 对应 一种 引物6、 加盖盖紧，离心7、 打开 Mrd_RT Star Run Open Lid 按顺序摆好 Close Lid Star Run 选好文件夹，保存好，开始。Western Blot细胞蛋白收样 （冰上操作、无酶EP管、无酶枪头）1、n个

25、样，n*2 个EP管（一式两份），实验前2-3分钟准备试剂（RIPA、PI），打冰。2、把 要收的样 小心吸弃培养基，注意一组一枪头。3、1ml冷冻的 PBS 清洗，吸弃，换组换枪头。4、 配蛋白裂解液：六孔板 每孔150l/十二孔板 每孔 100l，多配一点，RIPA：PI=100：1。5、 按体系算好，加入，晃匀，4冰箱孵育30min，打开4离心机。6、 用200l枪头吸匀刮取后加入至tube管，12000x/g（即12000rcf）离心15min7、 移上清至新无酶小管（先吸上部分，下部分10l枪头慢慢吸，维持140l150l），收样完后-80保存。蛋白浓度测定 （冰上操作、无酶tube

26、管、无酶枪头）1、BCA法BCA试剂：取50份试剂A与1份试剂B混合均匀。此试剂可稳定一周。（需先计算体系，即）标准蛋白质溶液：所买试剂浓度5mg/ml，用时稀释成1mg/ml的溶液。（从5mg/ml的标准蛋白溶液吸取12.6l加入50.4l的RIPA共配63l的1g/l的标准蛋白溶液）实验操作：绘制标准曲线取96孔酶标板，按下表加入试剂。 标准曲线的绘制（表1）管号12345678标准蛋白溶液（l）0124812162063lRIPA（l）2019181612840BCA试剂（l）200200200200200200200200蛋白质浓度（mg/ml）00.0250.050.10.20.30

27、.40.5上述试剂加完后，准确吸取20l样品（10l样品+10l RIPA）溶液于酶标孔中，加入BCA试剂200l，轻摇，于37保温30-60min，冷却至室温后，以空白为对照，在酶标仪上590nm处比色- 打开酶标仪，把96孔板盖去掉放进酶标仪并合上，电脑打开Gen5，点击BCA.pot，点OK即可导出Excel。 以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照，根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量- 保存Excel文件，选中测得标准蛋白溶液吸光度为横坐标，蛋白质浓度为纵坐标，插入XY散点图，右击表中的散点，添加趋势线，选择多项式，勾选显示公式以

28、及R平均值。将样品吸光值copy成列，将样品测得 吸光值 带入公式即可求得C所测样品稀释后浓度，由于所测20l样品是10l原样品+10l PBS，即稀释2倍，所以C该样品实际浓度= 2×C所测样品稀释后浓度，n该样品体系最小物质量=C最小所测体系浓度 * V最小浓度体积，V所取体积=n该样品体系最小物质量/C该样品体系浓度，VSDS=V所取体积/4。（V最小浓度体积为测得最小浓度的样品剩下体积；C所测样品稀释后浓度为代入公式后的浓度）蛋白变性在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上

29、样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。上样体积 ： 5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（Loading Buffer）=4:1，离心一下，沸水煮 10分钟，以充分变性蛋白。一、 流程图制胶（1h）电泳跑胶(80V 40min 110V 140min & 90V 30min )转膜（80V 50min&）TBST清洗5次（每次5min）封闭（1.5h）TBST清洗5次（每次5min）附抗（内参：小鼠抗-Actin，先摇床轻摇30min，再放冰箱4度过夜） TBST清洗三次（5min/次）附抗（内参：山羊抗小鼠，轻摇1h）TBST清洗三次（5min

30、/次）显影二、 物料及配制1、 电泳液：一包电泳粉+1000ml双蒸水（可回收使用）2、 10%过硫酸铵：1g过硫酸铵+10ml双蒸水3、 转膜液：一包转膜粉+800ml双蒸水+200ml甲醇（可回收使用）4、 TBST溶液：50ml 20*TBS+950ml双蒸水+1ml吐温20。（无需回收）5、 封闭液：购买6、 抗（内参）：将小鼠抗-Actin：稀释液 按1:500稀释待用，4度保存。抗（目的蛋白58kDa）：将smad2：稀释液 按1:1000稀释待用，4度保存。7、 抗（内参）：将山羊抗小鼠：抗稀释液 按1:5000稀释代用，4度保存。抗（目的蛋白58kDa）：将山羊抗兔：抗稀释液

31、按1:5000稀释待用，4度保存。 7、显影液：按说明书配制，避光可长期回收使用 8、定影液：按说明书配制，可长期回收使用 9、发光液：超敏发光液A液：B液=1:1三、步骤（一） 制胶1、 Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳12%分离胶溶液的配制溶液成分成分体积（共约7.2ml）双蒸水2.376ml30%丙烯酰胺溶液2.88ml1.5mol/L Tris（pH8.8）1.8ml10%SDS72l10%过硫酸氨72lTEMED（最后放，混匀）4l2、 Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所用溶液溶液成分成分体积（共约4.5ml）双蒸水2.544ml30%丙

32、烯酰胺溶液0.74ml1.5mol/L Tris（pH6.8）1.125ml10%SDS45l10%过硫酸氨45lTEMED（最后放，混匀）6l 3、1）将规格1.0mm或其它规格的玻璃板固定好。 2）依次将所需试剂加入烧杯中，加入TEMED之后，混匀，用1000ml的移液枪沿玻璃板缝左右两边的角交替加入分离胶溶液，也可从左到右连续加入（目的：两种方法都可以使液面快速达到水平状态）。溶液加至玻璃板约2/3高度（即插梳子离水平面大约1.5cm），然后加双蒸水至满或溢出。室温放置约1h，因受温度影响，具体时间以胶凝固并且水平为标准（可稍微倾斜玻璃板观察胶是否已经凝固）。如果胶凝固后未达到水平状态，

33、需重做。 3）积层胶溶液的加入同上，使溶液至满或略低，将对应1.00mm规格的梳子嵌入积层胶溶液（同时按压梳子两侧），室温（25度左右）放置约1h，因受温度影响，具体时间以胶凝固并且水平为标（可稍微倾斜玻璃板观察胶是否已经凝固）。注：TEMED的量要严格把握！若配制的胶过早凝固导致液面未达到水平状态，或者长时间不凝固，最可能的原因是加入TEMED时出现了较大误差。天气较冷时（10度左右），凝固时间会延长，可放恒温箱中37度加速凝固。（二） 跑胶电泳液的配制（凝胶时配好）溶液成分成分体积（共约1200ml）双蒸水1200ml甘氨酸22.56gTris Base3.6gSDS1.2g1、将玻璃板放

34、入电泳槽中，加入适量电泳液（要淹没玻璃板顶部）。在梳子两边同时用力，将其拔出。2、在积层胶最左侧或最右侧的孔中加入5l 的Mark，然后在剩余孔中依次加入30l蛋白提取液（蓝色）。加入的Mark和蛋白液的量可适当调整。加入时一定要仔细，视线要与孔保持水平，保证所加蛋白提取液全部落入孔中，否则会影响后期含量测定。3、开始跑胶1）将电压调为80V，一直至蓝色接近玻璃板底部停止（约40min，分离效果较好）。2）将电压调为80V，当蓝色过了积层胶与分离胶的分界线，可将电压调为110V，一直至蓝色接近玻璃板底部停止（140min，分离效果不如上面方法好）。（三） 转膜转膜液的配制（电泳时配好，甲醇转膜前30min加入，）溶液成分成分体积（共约1200ml）双