木犀草素体内抗炎作用机制研究

1、木犀草素体内抗炎作用机制研究         11-03-22 10:40:00     编辑：studa20                       作者：张毅，王旭光，杨展，何惠娟【摘要】  目的 探讨木犀草素(Lut)的体内抗炎疗效及作用机

2、制。方法 采用角叉菜胶致大鼠足爪肿胀模型，观察Lut对足爪肿胀度的影响；酶免疫测定法( EIA)测定炎足足跖部的渗出液前列腺素E2（PGE2）的含量；免疫组织化学法(IHC)及免疫印迹(Western blot)法检测角叉菜胶致炎大鼠足爪组织环氧合酶2（COX2）的表达情况。结果 Lut可抑制角叉菜胶致炎的大鼠足爪肿胀。80、120 mg/kg Lut可显著降低足爪炎症组织前列腺素E2（PGE2）生成，并显著抑制炎足爪中COX2的蛋白表达。结论 Lut具有较强的抗炎作用，其机制可能与抑制COX2的表达及PGE2的释放有关。 【关键词】  木犀草素；环氧合酶2；炎症；前列腺素E2

3、60;       Abstract: Objective   To investigate the antiinflammatory effect and mechanism of luteolin invivo. Methods   The model of carrageenaninduced edema of rat hind paws was prepared. The edema model was treated with luteolin and dexamethasone (f

4、or a positive control). The PGE2 content in the edema exudate was measured by EIA. The COX2 expression of the edema paws was detected by immunohistochemistry and Western blot. Results   Luteolin reduced the paw edema, the PGE2 contents in the exudate and the COX2 protein expression in the

5、edema paws. Conclusion  Luteolin has an antiinflammatory effect on rat inflammation induced by carrageenan probably through the mechanisms of the inhibition of COX2 protein expression and of PGE2 production.     Key words: luteolin; cyclooxygenase2; inflammation；prostaglandin E2

6、    木犀草素(Luteolin，Lut)属于黄酮类化合物，主要存在于菊花、忍冬花、紫苏叶等天然药物，近年研究表明Lut具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等作用12。我们研究发现Lut在体外能抑制环氧合酶2(COX2) mRNA及蛋白表达，同时降低NFB的DNA结合活性和蛋白表达3，其抗炎机制可能与此有关。为进一步探讨Lut的抗炎作用机制，我们建立大鼠足爪肿胀炎症模型，研究Lut对炎症大鼠 COX2 表达及前列腺素E2（PGE2）生成的影响。    1  材料和方法    1.1 

7、材料    清洁级雄性SD大鼠，体质量150250 g，由广东医学院实验动物中心提供。角叉菜胶、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等为美国Sigma 公司产品；Lut（纯度>98%）和PGE2 EIA Kit为美国Cayman公司产品；actin山羊IgG多克隆抗体、COX2山羊IgG多克隆抗体、免疫组化SP试剂盒均为北京中山公司产品；PVDF膜为美国Pall Gelman公司产品。    1. 2  方法1.2.1  大鼠分组50只大鼠随机分为5组，分别为空白对照组、2mg/kg地塞米松(Dex)阳性对照组及40、8

8、0、120mg/kg Lut 3个剂量组，每组10只。实验时分别腹腔注射等体积生理盐水、地塞米松及40、80、160mg/kg剂量的Lut。1.2.2  大鼠足爪肿胀测定 腹腔注射给药30 min后于大鼠右后足跖皮下注射1% 角叉菜胶0.1mL/只致炎，分别在致炎前，致炎后0.5、1、2、3、4、5 h用大鼠足爪容积测定仪测量炎足爪容积，计算各组大鼠不同时间点足爪肿胀度。    肿胀度(mL)=致炎后右后足容积致炎前右后足容积。1.2.3  大鼠足爪炎性渗出物中PGE2含量的测定 大鼠右后足致炎5 h后处死大鼠，于大鼠右踝关

9、节处剪下足爪，称重剥皮浸泡于5 mL 生理盐水中浸泡30 min，取出足爪，离心浸泡液15 min(3000×g)，取上清液0.5 mL，以PGE2 EIA Kit测定其中的PGE2含量(g/g)，并计算抑制率。抑制率IR(%)=对照组PGE2含量-给药组PGE2含量对照组PGE2含量×100%1.2.3  Western blot 取足跖致炎组织约20 mg加入0.2 mL细胞裂解液在匀浆器中匀浆后，将裂解液于冰上超声破碎细胞（10s/次×3次，间隔15s），4，12 000g离心10 min, 收集上清液，考马斯亮蓝（G250）染色法测上清

10、液蛋白质含量。每组各取50 g蛋白质样品加上样缓冲液煮沸变性后，进行10%SDS PAGE；电转移至PVDF膜；用含5%脱脂奶粉的TBS(PH8.0)封闭2 h；分别加入适量COX2和actin多克隆抗体，摇床上室温反应2 h；洗膜3次每次20 min；加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温反应2 h；洗膜后作ECL化学发光，X片曝光显影。图像经扫描仪扫描后，用图像分析软件BandScan 5.0进行光密度积分值分析，计算目的蛋白与内参照actin蛋白表达量的光密度积分值之比作为目的蛋白表达量的相对含量值。1.2.4  免疫组织化学（IHC） 取足跖部位的组织，用10%中性缓冲福

11、尔马林及时固定，石蜡包埋，切片，贴片，常规脱蜡。0.1mol/L PBS(pH 7.4)浸泡5 min。微波修复抗原。滴加正常山羊血清封闭液(试剂B)，室温20 min。滴加1:50稀释的COX2羊IgG单克隆抗体，阴性对照以PBS代替一抗，于4孵育过夜。PBS洗3次。滴加链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液(试剂C)，室温孵育10 min， PBS冲洗3次。滴加试剂SABC(试剂D)，37，30 min，PBS冲洗3次。DAB显色。苏木素轻度复染。脱水，透明，中性胶封片。显微镜观察。结果判断：以胞浆出现淡黄至褐黄色细颗粒状着色为阳性细胞，光学显微镜下观察，每组随机计数500个细胞，计算阳性表达率。同时观察染色强度，按染色强度着色淡黄为弱阳性（+），棕黄为阳性（），棕褐为强阳性（），无着色为阴性（）。1.2.5  统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行分析，行单因素方差分析及Dunnett's检验，以P<0.05为差异有统计学意义。    2  结果    2. 1  Lut对角叉菜胶诱导大鼠足爪肿胀的影响    结果表明，40 mg/kg Lut组在0.5、1、2、3、4、5 h