植酸酶的检测方法-饲用植酸酶活性的测定

1、饲用植酸酶活性的测定 分光光度法1 范围本标准规定了以分光光度法测定饲用植酸酶活性的方法。 本标准适用于作饲料添加剂用的植酸酶产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。样品最低检出量为90Ukg。2 引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准的最新版本的可能性。 GBT 66821992 分析实验室用水规格和试验方法(neq ISO 3696：1987)3 植酸酶活性单位定义 样品在植酸钠浓度为5.0 mmolL、温度37、PH值5.00的条件下，每分钟从

2、植酸钠中释放1mol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。4 方法原理 植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理会生成黄色的(NH4)3PO4NH4VO316MoO3复合物，在波长415nm下进行比色测定。5 试剂和溶液 本标准中所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GBT 6682中规定的三级水。 清洗试验用容器不要用含磷清洗剂。5.1 0.25molL 乙酸缓冲液(I)称取34.02g三水乙酸钠于1000mL容量瓶中，加入900mL水溶解，用冰醋酸调节pH至5.000.01，并用蒸馏水定容至1000mL，室温下存放

3、2个月有效。5.2 0.25molL乙酸缓冲液()称取34.02g三水乙酸钠，0.5g TritonX-100,牛血清白蛋白（BSA）于1000mL容量瓶中，加入900mL水溶解，用冰醋酸调节pH至5.000.01，并用蒸馏水定容至1000mL，室温下存放2个月有效。5.3 植酸钠溶液 c(C6H6O24P6Na12)为7.5mmolL称取0.6929g肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)于100mL。容量瓶中，用0.25molL乙酸缓冲液(5.1)溶解并定容至刻度，用冰醋酸调节pH至5.000.01，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0 mmolL)。5.4 硝酸溶液：1+2水溶液

4、。5.5 100gL钼酸铵溶液称取10g钼酸铵(NH4)6Mo7O244H2O于100mL。容量瓶中，加入1.0mL氨水(25)用水溶解定容至刻度。5.6 2.35 gL钒酸铵溶液称取0.235 g钒酸铵(NH4VO3)于100mL棕色容量瓶中，加入2 mL硝酸溶液(5.4)，用水溶解定容至刻度。避光条件下保存一周有效。5.7 颜色终止液移取2份硝酸溶液(5.4)，1份钼酸铵溶液(5.5)，1份钒酸铵溶液(5. 6)混合后使用，现用现配。(注意：不要有白色乳状沉淀，加硝酸要慢)5.8 植酸酶标准品(标明准确活性单位和类型)。5.9 磷酸二氢钾(KH2PO4)：基准物。6 仪器和设备6.1 实验

5、室常用仪器设备。6.2 恒温水浴：(370.1)。6.3 分光光度计：有10mm比色皿，可在415nm下测定吸光度。6.4 磁力搅拌器。6.5 涡流式混合器。6.6 酸度计：精确至小数点后2位。6.7 离心机：转速为4000rmin以上。7 试样制备 取有代表性样品，用四分法将试样缩分至200g，植酸酶产品不需粉碎，配合饲料和添加剂预混合饲料需粉碎通过0.45mm标准筛，装入密封容器，防止试样成分变化。8 测定步骤8.1 绝对法(仲裁法)8. 标准曲线 准确称取0.6804g在105烘至恒重的基准磷酸二氢钾(5.9)于100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液(5.2)溶解，并定容至100mL浓度为50

6、.0mmolL。按表1的比例稀释成不同浓度，与试样一起反应测定，以无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程(yax+b)。 表1标准序号稀释量mL浓度(mmolL)10.512520.5212.530.546.2540.583.12550.5161.562 5 试样溶液的制备 按照附录A中建议的称样量称取试样两份，精确至0.0001 g，置于100 mL容量瓶中，加入约70mL乙酸缓冲液()，一个磁力棒，在磁力搅拌器(6.4)上高速搅拌30min，用乙酸缓冲液(5.2)定容至刻度(减去磁力棒的体积)。摇匀，在离心机(6.7)上以4 000rmin离心10min。分取不同体积的上清液

7、用乙酸缓冲液(5.2)稀释（一般取2ml上清夜到50ml容量瓶中），使样液浓度保持在UmL。左右，待反应。 建议在测定样品时附加一个已知活性的植酸酶参考样，便于检验整个操作过程是否有偏差。以玉米芯、麸皮等为载体时可提高缓冲液5.2中TritonX-100及BSA的浓度至0.5% 反应 取10mL试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物(5.3)开始，向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致，37水解30min。 反应步骤及试剂、溶液用量见表2。 表2 反应顺序样品、标准样品空白(标准空白)1.加乙酸缓冲液(5.1或5.2)1.8 mL1.8 mL(2.0 mL)0.2 mL0.2

8、 mL437预热5 min5.依次加入底物(5.3)4 mL4 mL(第二步)水解30min8.依次加入终止液(5.7)4 mL4mL(第一步)总体积10 mL10 mL 样品测定 反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机(6.7)上以4 000rmin离心10min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计(6.3)415 nm波长处测定样品空白(A。)和样品溶液(A)的吸光值，A-A0。为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。9 结果计算和表示9.1计算公式试样中植酸酶的活性,用每克(或ml)试样中的活性单位“U”表示, 计算公式如下： 绝对法U(1)式中：U试样中植酸酶的活性，UgC根据实际样液的吸光值由直线回归万程计算出的x值，U；F试样溶液反应前的总稀释倍数。m试样质量，g或mL30反应时间，min9.2 结果表示 两个平行样品的测定结果用算术平均值表示，保留整数。9.3 重复性 同一样品两个平行测定值