毕赤酵母摇瓶产木聚糖酶发酵条件的优化

1、毕赤酵母摇瓶产木聚糖酶发酵条件的优化孙爱萍 1 谌晓华 1 贾 伟 1 万红贵 2(1. 江西诚志生物工程有限公司 , 江西 鹰潭 335000;2. 南京工业大学制药与生命科学学院 , 江苏 南京 210009摘要 :对毕赤酵母摇瓶发酵产木聚糖酶的培养条件进行优化 , 该菌产木聚糖酶的最佳碳源为麸皮 , 最佳氮源为酵母膏 ;摇瓶培养条件为 30 、 接 1种量 10%、 初始 pH5.间为 18h , 经优化后 , 木聚糖酶酶活达到 1765I 。关键词 :毕赤酵母 木聚糖酶 自然资源 ,-1,4-木糖苷键 , 可将木聚 糖水解为木二糖和木二糖以上的低聚木糖 12, 以及 少量木糖和阿拉伯糖

2、 , 在饲料 、 造纸 、 食品及生物转化 等行业具有广阔的应用前景 36。产木聚搪酶的微生 物分布很广包括细菌 、 放线菌 、 真菌以及某些酵母 , 而 国内对酵母菌产酶的研究较少 , 本文重点研究了摇瓶 条件下的最佳发酵条件 。1 材料与方法1. 1 菌种 巴斯德毕赤酵母基因工程菌 , 由南京工业 大学实验室保存1. 2 主要材料桦木木聚糖 购自 S igma 公司 ;DNS (3,5-硝基水 杨酸 中国医药集团上海化学试剂公司 ;麸皮为南京市郊区购得 ; 其他试剂为国产分析纯 ; 1. 3 主要设备HYG-A 全温摇床柜太仓设备厂 ;pHS -3C 精密 pH 计 上海精密科学仪器有限公

3、司 ; S pectrum L752s 紫 外可见分光光度计 上海棱光技术有限公司1. 4 摇瓶发酵培养方法将种子液接入装有 50m L 的发酵培养基的 500m L 摇瓶中 ,8层纱布封口 , 置于旋转式摇床上振荡培养 。 所有试验重复 3次 , 取平均值 。1. 5 酶活国际单位 (I U 定义在本试验条件下 , 以木糖为标准 , 在温度为 70 、 pH 为 6. 0的最适酶促反应条件下 , 以每 1min 生成 1m ol 还原糖所需的酶量作为一个酶活力单位 , 为 1个 国际单位 (I U 。1. 6 酶液的制备毕赤酵母液体培养发酵液 , 经 8000r/min 离心 15 min

4、的上清液并适当稀释即为本实验所用酶液 。1. 7 酶活测定方法参照 DNS 法 7, 取稀释酶液 0. 1m L , 加 1%木聚糖 0. 9m L , 置 70 水浴保温 10min 然后加入 DNS 试剂 3 m L 于沸水浴中显色反应 5min , 迅速冷却至室温并加蒸 馏水定容至 20m L ,540nm 处比色测定 。2 结果与讨论2. 1 碳源的选择碳源是组成培养基的主要成分之一 , 其主要功能 有两个 :一是为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合 成菌体所必需的碳成分 ; 二是为菌体合成目的产物提 供所需的碳成分 。碳源物质不仅能够促进菌体生长 , 而且外源基因 在表达过程中也需要消

5、耗较多的能量 。常用的碳源有 糖类 、 油脂 、 有机酸和低碳醇等 。本研究选用了不同的 碳源进行产酶实验 , 结果见表 1。表 1 不同碳源对产酶的影响碳源种类米糠 麦麸米糠 +麦麸葡萄糖 甘油 米糠酶活2. 3 氮源的选择氮源主要用于构成菌体细胞物质 (氨基酸 、 蛋白 质 、 核酸等 和含氮的目的产物 , 是构成菌体细胞蛋白 和核酸的物质来源 , 与培养过程中菌体得正常代谢有 着重要关系 。以麦麸为碳源 , 分别考察了有机氮源牛肉膏 、 酵母 浸膏 、 蛋白胨及无机氮源硫酸铵 、 尿素对酶活的影响 , 结果见表 2。96 2009年 3月 毕赤酵母摇瓶产木聚糖酶发酵条件的优化 表 2 不

6、同氮源对产酶的影响氮源 种类 牛肉膏 酵母 浸膏 蛋白胨 酵母膏 +蛋白胨 尿素 硫酸铵 酶活(-1 796978528510217284 从实验结果可以看出 , 有机氮源明显优于无机氮 源 , 其中酵母浸膏可使酶活接近 1000I U/ml , 加之牛肉 膏价格因素 , 因此选用酵母浸膏作为氮源进行发酵 。 2. 3 正交试验通过 4因素 3水平的正交实验确定摇瓶中毕赤酵 母产酶的最佳培养条件 , 正交设计及实验结果见表 3和表 4表 3 因素 、 水平表 水平温度 A接种量 D164. 50. 5%2105. 51. 0%根据正交试验表 L 9(34 进行正交试验 , 结果见表 4。运 用

7、极差分析方法可知 :4个因素影响产酶的主次顺序为 R C >R D >R A >R B , 也就是 pH 是影响产酶的主要因子 , 接种量影响最小 。表 4 正交实验结果及分析 实验号温度接种量pH 甲醇 浓度 实验 结果 1 均值 11199. 6671216. 6671159. 6671158. 333均值 21283. 6671242. 3331391. 6671323. 667均值 31165. 0001189. 3331097. 0001166. 333图 1 因素 、 水平与产酶的关系 (趋势图 因素 、 水平与产酶的关系 (趋势图 见图 1, 由图可知 , 因素

8、 A 中以 A 2的 k 值最高 ,B 中为 B 2,C 中为 C 2,D 中为 D 2, 所 以 优 势 水 平 组 合 为 A 2B 2C 2D 2。即 温 度 为30 、 接种量为 10%、 初始 pH5. 5、 初始甲醇含量 1. 0%, 以此组合进行试验 ,3次重复 , 得到结果为 1653I U/ml -12. 4 甲醇诱导时间的研究毕赤酵母在诱导表达阶段 , 甲醇作为诱导物的同 时又是碳源和能源 。 分别选择发酵开始后的 0、 18、 24、 36、 48h , 以观察最佳的诱导时 间 , 结果如图 2。 18h 后开始进 , 由 , , 而如果诱导时间较晚也 , 可能是因为甲醇

9、诱导培养过程中 , 随着诱导时间的增长 , 目的蛋白表达量也逐渐增多 10, 因此确定 18h 为甲醇诱导开始时间 。图 2 甲醇诱导时间对产酶的影响2. 5 毕赤酵母木聚糖酶耐热性通常不同菌种来源的木聚糖酶其最适反应温度是不同的 。由图 2-5可以看出 , 本研究获得的木聚糖酶 在 70 时酶活最高 , 且该酶在 80 时仍然具有较高的 活力 , 这在已报导的毕赤酵母表达产酶中是最耐热的 , 具备工业化耐高温酶制剂的要求 。图 3 温度对酶活性的影响注 :以反应温度 50 的测定值为 100%7江 西 化 工 2009年第 1期 3 小结本研究通过对毕赤酵母菌株产木聚糖酶发酵条件 进行了研究

10、 , 得到该工程菌最佳碳源为麸皮 , 最佳氮源 为酵母膏 , 通过正交实验得到工程菌的最佳摇瓶培养 条件为 30 、 接种量 10%、 初始 pH5. 5、 初始甲醇含量 1. 0%, 并确定了甲醇最佳诱导时间为 18h 。该酶的耐 热稳定最高为 70 。参考文献1G eorgi T odorov D obrev , lvan G enov Pishtiyski , VeselinS tanchev ,et al. Optimization of nutrient medium containing agricultural wastes for xylanase production by

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15、, Nanjing Univer sity o f Technology , Nanjing 210009, China Abstract :The flask liquid fermentation conditions for producing xylanase by Pichia pastoris were investigated. The prime flask cul 2tivate condition was obtained by using orthog o -naldesign :temp 30 ,inoculate quantity 10%,pH 5. 5,methanol 1. 0%.The xy 2lanase activity reached