呼吸道合胞病毒建立哮喘动物模型中气道胆碱能神经的分布(一)

1、呼吸道合胞病毒建立哮喘动物模型中气道胆碱能神经的分布一【摘要】目的：用呼吸道合胞病毒RSV诱发豚鼠哮喘模型，通过检测 气道反响性和气道平滑肌层胆碱能神经分布变化，研究神经机制在哮 喘发病中的作用方法：34只豚鼠随机分为4组：Hep 2滴鼻+生理 盐水NS雾化Hep 2/NS组，rsv滴鼻+ ns雾化rsv/ns组,Hep 2 滴鼻+鸡卵白蛋白OVA雾化Hep 2/0VA组和rsv滴鼻+ ova雾化 RSV/ovA!,其中 Hep 2/NS 组和 rsv/ns组动物各 9 只，Hep 2/OVA 和RSV/OVA组动物各8只，以Hep 2/NS组为对照组.电刺激迷走神经 法检测气道反响性，计数气

2、管粘膜和粘膜下嗜酸性粒细胞Eos,行胆碱能神经纤维免疫组化并计数阳性纤维数目结果：气道内压力IP:rsv/ns组与Hep 2/N5组之间差异无统计学意义po.o5,Hep 2/OVA 组IP明显高于Hep 2川S组和RSV/NS组P均0.05, RSV/OVA组IP明 显高于 Hep 2/0VA 组P0.01； Eos Hep 2/NS 组与 rsv/ns组之间差 异无统计学意义p0.05, Hmp 2/0VA组高于Hep 2/NS组和rsv/ns 组P均0.05, rsv/ova组明显高于Hep 2/0VA组P0.01；平滑肌层 有胆碱能阳性纤维分布：rsv/ns组与Hep 2/NS组之间差

3、异无统计学 意义P0.05, Hep 2/0VA组阳性纤维数目明显高于Hep 2/N5组和 RSV/NSSP0.01,但RSV/OVA组与Hep 2/OVA组之间差异无统计学 意义P0.05结论：RSV感染可促进OVA引起的豚鼠AHR发生；OVA可导致气道平滑肌层胆碱能阳性纤维分布增多，但RSV对其增多无明显影响.【关键词】呼吸道合胞病毒；哮喘；支气管高反响性；嗜酸细胞；胆碱能纤维哮喘是困扰人类呼吸道健康的主要疾病之一，其发病机制错综复杂， 至今尚未明确.目前，大量调查研究证实呼吸道合胞病毒respiratorysyncytialvirus,RSV感染可诱发哮喘1动物实验中也发现， 呼吸道RS

4、V感染后给予鸡卵白蛋白ovalbumin,0VA雾化吸入，可导致 小鼠发生明显的气道高反响性、肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞 eosinophils,Eos数目增多等表现2气道反响性主要受气道胆碱能神 经的支配本实验中我们尝试以RSV感染结合OVA雾化吸人，复制哮喘 豚鼠模型，通过研究气道胆碱能阳性神经纤维的分布状况，探索RSV感染诱发哮喘的神经机制.1材料和方法1.1材料雌性豚鼠34只，体质量250300g由第四军医大学实验动物中心提供； RSVLo ng株A型和HEp 2细胞西京医院儿科实验室惠赠； RPMI1640美国GIBCO公司；胎牛血清甘肃民海生物工程； OVA II级美国Sigma公司

5、；ChAT式剂盒美国Chemicon公司；超声 波细胞粉碎机JY92-II宁波新芝科技股份；二道生理记录仪 甘肃国营永红器材厂；动物呼吸机浙江医科大学医学仪器实验厂.1.2方法病毒培养RSV接种于HEp 2单细胞层，以含20g/L胎牛血清的RPMI1640为培 养液，37C ,50mL/LCO2孵育、传代至75%以上的细胞发生病变收集细 胞，低温超声破碎细胞，4C条件下离心10000g,10mi n,收集上清，分 成4份，-20C冻存备用.动物分组及制模34只豚鼠随机分为4组：HEp 2滴鼻+生理盐水(normalsaline,NS雾 化(Hep 2/NS)组，rsv滴鼻+ ns雾化(rsv/

6、ns组，Hep 2 滴鼻+ ova 雾化(Hep 2/OVA)组和rsv滴鼻+ ova雾化(rsv/ova组,其中 Hep 2/NS和RSV/NS组动物各9只，Hep 2/OVA和RSV/OVA组动物 各8只，以Hep 2/NS组作为对照组乙醚吸入麻醉下给予Hep 2细 胞培养液或RSV悬液250mL滴鼻吸入，第2日相同剂量加强1次.第7 日开始给予1g/mLOVA或者NS隔天雾化吸入，每次30min，持续2wk.第4日各取Hep 2/NS组和RSV/NS组豚鼠1只，心脏注射空气致死， 无菌条件下取肺组织，均浆，接种于Hep 2细胞，观察细胞变化情况.气道反响性检测感染后第21日，豚鼠以乌拉坦

7、1.8g/kg腹腔注射麻醉，气管插管，一 侧侧孔接压力传感器，经二道生理记录仪记录气道内压力 (intra airwaypressureJP)( cmH2O,1cmH2O= o.1kPa),另一侧连接动物 呼吸机.参数设置：潮气量10mL/kg，频率：60次/min，记录IP用蚊式 止血钳钝性别离双侧迷走神经约1cm，结扎，剪断，浸入石蜡油以免坏死，远端置于保护电极上，连接电刺激器.参数设置：频率225Hz,脉冲宽度0.20ms,幅度10V,每段刺激时间60s,间歇时间2min.给予 电刺激后记录IP的变化病理学观察主动脉穿刺，同时剪开右心耳，生理盐水灌注冲洗，取主气管和左肺常规40g/L甲醛

8、溶液固定，24h后以300g/L蔗糖缓冲液置换，冰冻包 埋剂包埋，恒冷箱连续切片，片厚16 m,冷风枯燥后，进行HE染色， 400 光镜下随机选10个视野，计数支气管粘膜，粘膜下细胞总数和Eos 的数目，计算每视野平均数个/视野.胆碱能神经免疫组化免疫组化按ChAT试剂盒中的操作步骤进行.切片以PBS漂洗，100g/L 正常牛血清中室温孵育15min,羊抗ChAT： 1000孵育，4C过夜，再 于驴抗羊血清中室温孵育4h，然后于1 : 200的A, B混合液孵育2h, 最后用DAB进行成色反响10min, PBS漂洗，乙醇梯度脱水，二甲苯透 明，DPX封片.阴性对照组给予抗体稀释液代替一抗，其余同上.以气管 分叉处气道