综合实训二鸡新城疫抗体测定实训指导

1、综合实训二 鸡新城疫抗体测定目的要求 熟练掌握病毒的血凝试验与血凝抑制试验（微量法）的操作方法及结果判定，能用病毒的血凝试验与血凝抑制试验进行鸡新城疫抗体测定。仪器及材料、0.01mol/L PBS或生理盐水、3.8%枸橼酸钠、新城疫病毒液、离心机、天平、烧杯、新城疫病毒液、新城疫标准阳性血清、新城疫标准阴性血清、微量血凝板（V型96孔）、微量移液器（带吸头）、微型振荡器、温箱、注射器。 方法与步骤一、1鸡红细胞悬液的制备 采成年健康、0.01mol/L PBS磷酸缓冲盐水洗涤34次，每次以2000r/min离心34min，最后一次5min。每次离心后弃去上清液，并彻底去除白细胞，最后用PBS

2、稀释成1红细胞悬液。二、被检血清的制备 静脉或心脏采血（不加抗凝剂），血液凝固后自然析出或离心得到的淡黄色液体即为被检血清。三、血凝试验操作术式（实表1）实表1 病毒血凝试验操作术式（以新城疫病毒为例） 单位: l孔号123456789101112PBS或生理盐水新城疫病毒液PBS或生理盐水病毒稀释倍数1%鸡RBC悬液25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 -弃2525 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 21 22 23 24 25 26 27 28 29 210

3、211 对照25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25振荡混匀，室温即2025下静置40 min后观察结果。若环境温度太高，放4静置60 min。生理盐水对照孔红细胞成明显钮扣状沉到孔底时判定结果。结果举例±±（1）用微量移液器吸取PBS，依次加入第112孔中，每孔25l。（2）换吸头，吸取25l病毒液加于第1孔的PBS中，并用移液器吹打35次使液体混和均匀，然后取25l移入第2孔,混匀后取25l移入第3孔,依次倍比稀释到第11孔，第11孔中液体混匀后从中吸出25l弃掉。第12孔不加病毒抗原，作对照。（3）换吸头，第112孔每孔再加25lPBS。

4、（4）换吸头，吸取1红细胞悬液依次加入第112孔中，每孔25l。（5）加样完毕，将反应板置于微型振荡器上振荡1min，室温即2025下静置3040 min后观察结果。若环境温度太高，放4静置60 min。生理盐水对照孔红细胞成明显钮扣状沉到孔底时判定结果。（6）结果判定及记录在生理盐水对照孔出现正确结果的情况下（生理盐水对照孔的红细胞成明显的钮扣状沉到孔底），将反应板倾斜，正确判读HA效价，以nlog2方式报告结果，并填写结果报告单。以完全凝集的病毒最大稀释度为该抗原的血凝滴度。完全凝集的病毒最高稀释倍数为l 个血凝单位( HAU ) 。新城疫病毒液能凝集鸡的红细胞，但随着病毒液被稀释，其凝集

5、红细胞的作用逐渐变弱。稀释到一定倍数时，就不能使红细胞出现明显的凝集，从而出现可疑或阴性结果。四、制备4个血凝单位的病毒液 HA价除以4即为4HAU抗原的稀释倍数。假设HA价为256，则4HAU抗原的稀释倍数为64，吸取1mL抗原加入63mL生理盐水即为4HAU抗原。五、血凝抑制试验操作术式（实表2）实表2 病毒血凝抑制试验操作术式 单位:l孔号123456789101112PBS或生理盐水待检血清待检血清稀释倍数4血凝单位的病毒25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 10025 25 25 25 25 25 25 25 25 25 弃2521 2 2 23 24 2

6、5 26 27 28 29 210 病毒 盐水 对照 对照 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 轻叩反应板使反应物混合均匀，室温即2025下静置不少于30min，4静置不少于60min。1% 鸡 RBC悬 液252525252525252525252525振荡混匀，室温即2025下静置40min后观察结果。若环境温度太高，放4静置60min。生理盐水对照孔红细胞成明显钮扣状沉到孔底时判定结果。结果举例±±（1）用微量移液器吸取PBS，加入第111孔中，每孔25l。第12孔加50l。（2）换吸头，吸取待检血清25l置于第孔的PBS中，吹打35次混

7、匀，吸出25l放入第2孔中，混匀后从第二孔中吸取25l置于第3孔中，然后依次倍比稀释至第10孔，并将第10孔的液体混匀后吸取25l弃掉。第11、12孔不加待检血清，分别作为病毒对照和盐水对照。（3）换吸头，以同样方法稀释标准阳性血清和标准阴性血清。（4）换吸头，用微量移液器吸取稀释好的4个血凝单位的病毒液，加入第111孔中，每孔25l。轻叩反应板使反应物混合均匀，室温即2025下静置不少于30min，4静置不少于60min。（5）换吸头，用微量移液器吸取1红细胞悬液分别加入第112孔中，每孔25l。再将反应板置于微型振荡器上振荡1530s，混和均匀。振荡混匀，室温即2025下静置40min后观察结果。若环境温度太高，放4静置60min。生理盐水对照孔红细胞成明显钮扣状沉到孔底时判定结果。（6）结果判断和记录在生理盐水对照孔出现正确结果（红细胞完全流下）的情况下，将反应板倾斜，从背侧观察，正确判读被检血清、标准阳性血清和标准阴性血清的HI效价，以nLog2方式报告结果，并填写结果报告单。只有当阴性血清与标准抗原对照的HI滴度不大于2log2，阳性血清与标准抗原对照的HI滴度与已知滴度相差在1个稀释度范围内，并且所用阴、阳性血清都不发生自凝的情况下，HI试验结果方判定有效。能完