生胃酮对大鼠颈动脉损伤后新生内膜过度增殖的影响

1、生胃酮对大鼠颈动脉损伤后新生内膜过度增殖的影响         10-08-11 14:25:00     编辑：studa20             作者：宋明宝，于学军，崔馨，陈剑飞，卢来春，赵刚，于世勇，董红梅，黄岚【摘要】  目的：观察生胃酮对大鼠颈动脉损伤后新生内膜过度增殖的影响。方法：采用组织贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞，Weste

2、rn blot检测生胃酮对大鼠主动脉平滑肌细胞缝隙连接蛋白43表达的影响。采用球囊损伤建立大鼠颈动脉损伤模型，对照组给予生理盐水2 mL、生胃酮组给予生胃酮3 mg/kg 腹腔注射，1次/d，HE染色观察新生内膜形成情况，免疫荧光染色检测新生内膜中缝隙连接蛋白43的表达，伊文思蓝DAPI双染色以评价新生内膜形成情况。结果：所培养的细胞抗SM actin免疫荧光染色阳性。50 mol/L生胃酮处理平滑肌细胞24 h后对缝隙连接蛋白43的表达无影响(0.85±0.06 vs 0.83±0.03，n=3，P>0.05)。球囊损伤大鼠颈动脉14 d后可见血管管腔狭窄、新生内膜

3、增生明显。免疫荧光染色显示形成的新生内膜中缝隙连接蛋白43表达丰富。经生胃酮干预后新生内膜增生明显减轻，新生内膜细胞计数显著低于对照组 (89±28.40 vs 236±15.04，n=5，P<0.01)。结论:缝隙连接在血管损伤后新生内膜形成过程中扮演重要角色，而缝隙连接阻断剂生胃酮能抑制新生内膜过度增生。 【关键词】  新生内膜;血管;缝隙连接;生胃酮;大鼠Abstract Objective: To observe the effect of carbenoxolone on neointimal hyperplasia after rat carot

4、id balloon injury. Methods: Rat aortic SMCs (RASMCs) were cultured by explanted rat aortic wall tissue and identified with cell immunofluorescence staining for SMactin. The expression of Cx43 in RASMCs which were treated with carbenoxolone at a concentration of 50 mol/L for 24 h was detected with we

5、stern blot. The model of vascular injury was established with rat carotid balloon injury. And animals were administrated with intraperitoneal injections of carbenoxolone 3 mg/(kg·d) in the carbenoxolone group or with saline (2 mL/d) in the control group for 2 weeks after carotid balloon injury.

6、 After 2 weeks, HE staining and DAPIEvens blue double staining were applied to evaluate the neointimal formation of targeted vessels. And cell immunofluorescence staining was used to detect protein Cx43 expression on targeted vessels. Results: RASCMCs were cultured successfully with positive immunof

7、luorescence staining for SM actin. In this experiment, we found that carbenoxolone couldn±±, n=3, P>0.05). Two weeks after carotid balloon injury, carbenoxolone could significantly reduce the neointimal formation and the stenosis of blood vessel lumen. When nuclei number of neointima wa

8、s used to evaluate the neointimal formation, result suggested that nuclei number of neointima in carbenoxolone group was significantly lower than that in the control group (89±28.40 vs 236±15.04， n=5， P<0.01). The expression of Cx43 protein in neointima was abundant. Conclusions: Gap ju

9、nctions play a key role in neointimal hyperplasia, and carbenoxolone, a special blocker of gap junction, can inhibit neointimal hyperplasia after rat carotid balloon injury.Key words Neointima; Vessel; Gap junction; Carbenoxolone; Rat血管损伤后不良修复反应是血管损伤性疾病如儿童过敏性紫癜、动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等的主要病理生理学基础，其中关键环节是血管平

10、滑肌细胞由血管壁中层向内膜迁移并增殖，从而导致新生内膜形成并导致血管狭窄。抑制新生内膜过度增殖是血管损伤性疾病防治的重要策略。缝隙连接是相邻细胞间的膜通道结构，它由细胞膜上的连接子相互衔接而成。每个连接子包含六个相同哑铃形蛋白质亚单位缝隙连接蛋白(connexin, Cx)、连接子即Cx的六聚体所形成的跨膜蛋白通道1。该跨膜通道可允许小的信号分子和离子通过，在维持组织动态平衡、调节细胞生长、发育及分化中具有重要作用1。近年来研究发现，Cx在血管损伤性疾病的发生、发展过程中具有重要作用。本研究在大鼠颈动脉损伤模型的基础上探讨缝隙连接特异性阻断剂生胃酮对血管损伤后新生内膜过度增殖的影响。1 材料与

11、方法1.1 材料1.1.1 试剂 DMEM/F12培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)及DAPI购于美国Gibco BRL公司;生胃酮及兔抗鼠平滑肌肌动蛋白(SM actin)单克隆抗体购于美国Sigma公司;羊抗缝隙连接蛋白43多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司; FITC标记的兔抗山羊IgG抗体购于北京中杉公司。1.1.2 实验动物 SPF级SpragueDawley大鼠，体重150180 g/只，购于第三军医大学实验动物中心，实验动物许可证号：SYXK(军)2002029。1.2 方法1.2.1 大鼠主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定 用颈椎脱臼法处死动物

12、，在无菌条件下取大鼠胸腹主动脉，仔细清除血管外膜及脂肪组织，将血管纵向剖开，用0.01 PBS漂洗干净，用眼科镊刮去血管内膜，放入50 mL培养瓶中，在瓶口用眼科剪剪成约1.5 mm×1.5 mm大小的组织块，用吸管将组织块随机铺于瓶底，放入37 、5%CO2的培养箱中贴壁4 h后加入含20% FBS及双抗的DMEM/F12培养基继续培养。以后每3 d更换培养液1次。采用抗SM actin免疫荧光染色鉴定血管平滑肌细胞。1.2.2 生胃酮对大鼠血管平滑肌细胞Cx43表达的影响 将培养的大鼠主动脉平滑肌细胞培养3 d后加入生胃酮使其终浓度为50 mol/L，置37 、5%CO2条件下继

13、续培养24 h。未加18 GA 预处理的细胞作为对照。收集细胞后经裂解液裂解，离心后取上清液，用Lowry法进行蛋白定量，十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)(11%分离胶、4%浓缩胶)电泳，400 V，上样量70 L。2 h后硝酸纤维素膜转印2 h，5%脱脂奶粉封闭2 h，羊抗大鼠Cx43多克隆抗体(11 000)孵育过夜，再与15 000 的HRP 标记的兔抗羊抗体结合(水平振荡摇床1 h)。ECL化学发光系统显影，X线片感光洗片，用凝胶成像分析仪进行蛋白相对定量分析。1.2.3 大鼠颈动脉球囊损伤模型的建立 参照韩雅玲等2的方法复制大鼠颈动脉损伤模型。简述如下：SD大鼠，用2%

14、戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔麻醉。取颈部正中切口，颈外静脉注射肝素钠100 U/kg。无菌条件下游离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，暂时阻断颈总动脉近心端及颈外动脉血流，结扎颈内动脉远心端，用眼科剪在结扎点旁距颈内动脉分叉点约3 mm处剪开动脉，将1.5 F的Fogarty球囊导管从切口处插入颈总动脉约1.5 cm，1.5大气压充盈球囊，使球囊刚好能在血管中拉动，在远心端缓慢回拉球囊至颈内、颈外动脉分叉处，重复拉动3次，每次间隔2 min，间隔期球囊处于充盈状态，以使损伤区缺血缺氧。结扎颈内动脉分叉处，常规缝合皮下组织和皮肤。14 d后处死动物，取出病变血管及对侧正常血管，OCT包埋后行冰

15、冻切片，经冷丙酮固定5 min后进行HE染色以观察新生内膜形成情况。1.2.4 血管损伤后形成的新生内膜中Cx43表达的检测 14 d后处死动物。步骤简述如下：(1) PBS漂洗1次;(2)0.3%TritonX100室温下孵育10 min;(3) PBS洗涤5 min×3次;(4) 10%正常兔封闭血清37 孵育20 min;(5) 吸弃封闭血清，滴加羊抗Cx43多克隆抗体(1100)稀释，阴性对照组用PBS替代一抗，置于湿盒中4 冰箱过夜;(6)PBS洗涤5 min×3次;(7)滴加FITC标记兔抗羊IgG(用0.3%伊文思蓝按1200稀释)，37 孵育60 min;(

16、8)PBS洗涤5 min×3次;(9)荧光倒置显微镜观察照相。1.2.5 生胃酮对血管损伤后新生内膜过度增殖的影响 实验分为对照组及生胃酮组。对照组在球囊损伤后给予生理盐水2 mL 腹腔注射，1次/d。生胃酮组在球囊损伤后给予生胃酮3 mg/kg3腹腔注射，1次/d。14 d后处死动物，取出病变血管段，OCT包埋后行冰冻切片，经冷丙酮固定5 min后行伊文思蓝DAPI双染色以评价新生内膜形成情况。步骤简述如下：(1) PBS洗涤2 min×3次;(2) 滴加DAPI工作液于切片上，避光室温下孵育2 min;(3) PBS洗涤2 min×3次;(4) 滴加0.3%伊文思蓝于切片上，避光室温孵育5 min;(5) PBS洗涤2 min×3次;(6) 荧光倒置显微镜观察，分别用绿色荧光和蓝色荧光对同一视野摄像，通过计算机图像分析软件Ima