抗生素类药物的分析

1、抗生素类药物的分析抗生素类药物的分析主要内容主要内容v概述概述v-内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素 v氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素学习要求学习要求1.掌握掌握 抗生素类药物的类型、结构、质量和抗生素类药物的类型、结构、质量和稳定性特点以及分析方法稳定性特点以及分析方法2.熟悉熟悉 各类抗生素药物的有关来源、特点和各类抗生素药物的有关来源、特点和检查方法检查方法第一节第一节 概概 述述 一、抗生素药物的定义和特点一、抗生素药物的定义和特点 1.定义定义：是生物（包括微生物、植物、动物）在其：是生物（包括微生物、植物、动物）在其生命活动中产生的（或并用化学、生物或生化方法生命活动中产生的（或并用化

2、学、生物或生化方法衍生的），能在低微浓度下有选择得抑制或影响它衍生的），能在低微浓度下有选择得抑制或影响它种生物机能的化学物质的总称。种生物机能的化学物质的总称。 2.特点：特点： 化学浓度低化学浓度低 （同系物多、异构体多、降解物多）（同系物多、异构体多、降解物多） 活性组分易发生异变活性组分易发生异变 （微生物菌株和发酵条件的改变）（微生物菌株和发酵条件的改变） 稳定性差稳定性差 （含有活泼基团）（含有活泼基团）二、抗生素类药物的分类二、抗生素类药物的分类1.根据产生抗生素的根据产生抗生素的生物来源生物来源分类分类2.根据抗生素的根据抗生素的作用对象作用对象分类分类3.根据抗生素的根据抗生

3、素的作用机制作用机制分类分类4.根据抗生素的根据抗生素的化学结构化学结构分类分类（1）-内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素 （2）四环类抗生素）四环类抗生素（3）氨基糖苷类抗生素）氨基糖苷类抗生素 （4）大环内酯类抗生素）大环内酯类抗生素 （5）多烯环类抗生素）多烯环类抗生素 （6）多肽类抗生素）多肽类抗生素 （7）酰胺醇类抗生素）酰胺醇类抗生素 （8）抗肿瘤类抗生素）抗肿瘤类抗生素 （9）其他类抗生素）其他类抗生素三、抗生素类药物的细菌耐药性三、抗生素类药物的细菌耐药性1.耐药性的种类耐药性的种类 固有耐药性和获得性耐药性固有耐药性和获得性耐药性2.耐药性的机制耐药性的机制（1）产生灭活酶，使抗菌

4、药失活（）产生灭活酶，使抗菌药失活（ -内酰胺酶，内酰胺酶，氨基糖苷类抗生素钝化酶，其他酶氨基糖苷类抗生素钝化酶，其他酶 ）（2）抗菌药物作用靶位的改变）抗菌药物作用靶位的改变（3）降低细菌外膜通透性）降低细菌外膜通透性（4）影响主动流出系统）影响主动流出系统四、抗生素药物的质量分析四、抗生素药物的质量分析（一）鉴别试验（一）鉴别试验 官能团的颜色反应（官能团的颜色反应（ -内酰胺环的羟肟酸铁反应）内酰胺环的羟肟酸铁反应） 光谱法（光谱法（IR、UV） 色谱法（色谱法（TLC和和HPLC） 生物学法生物学法（二）检查（二）检查1.影响影响产品稳定性产品稳定性的检查项目的检查项目 结晶性、酸碱度

5、和水结晶性、酸碱度和水分等分等2.控制控制有机和无机杂质有机和无机杂质的检查项目的检查项目 有关物质有关物质 、残留、残留溶剂溶剂、颜色颜色 、炽灼残渣炽灼残渣 、重金属等、重金属等 3.与与临床安全性密切相关临床安全性密切相关的检查项目的检查项目 异常毒物、热异常毒物、热原或细菌内毒素原或细菌内毒素 、降解物质、降解物质 、无菌等、无菌等4.其他项目其他项目 组分分析等组分分析等（三）含量或效价测定（三）含量或效价测定1.生物检定法（生物检定法（管碟法和浊度法管碟法和浊度法）：通过检测抗生）：通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）

6、的方法。的方法。 优点优点 缺点缺点 灵敏度高，与用量少灵敏度高，与用量少 操作步骤多操作步骤多 与临床应用要求一致与临床应用要求一致 测定时间长测定时间长 适用范围广适用范围广 测定误差大测定误差大2.理化方法：主要是理化方法：主要是HPLC法法 是根据抗生素的分子结构特点，利用其特有的化学是根据抗生素的分子结构特点，利用其特有的化学或物理性质及反应而进行的。或物理性质及反应而进行的。优点优点：迅速、准确地测定效价；较高专属性。：迅速、准确地测定效价；较高专属性。缺点缺点：只能测定药物的总含量，不一定能代表：只能测定药物的总含量，不一定能代表抗生素的生物效价；易受杂质干扰。抗生素的生物效价；

7、易受杂质干扰。3.抗生素活性表示方法：抗生素活性表示方法： 以效价单位表示，即指每毫升或每毫克中含有某以效价单位表示，即指每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。种抗生素的有效成分的多少。 效价是以抗菌效能效价是以抗菌效能(活性部分活性部分)作为衡量的标准，作为衡量的标准，因此，效价的高低是衡量抗生素质量的相对标准。因此，效价的高低是衡量抗生素质量的相对标准。效价基准效价基准： 同一种抗生素的各种效价基准是人们为同一种抗生素的各种效价基准是人们为 了生产科研方便而规定的。了生产科研方便而规定的。 一种抗生素有一种效价基准，同一种抗生一种抗生素有一种效价基准，同一种抗生素的各种盐类的效价

8、可根据其分子量与标准盐类素的各种盐类的效价可根据其分子量与标准盐类换算。换算。第二节第二节 -内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素 一、化学结构和性质一、化学结构和性质1.化学结构化学结构 青霉素和头孢菌毒素分子中都有有个游离羧青霉素和头孢菌毒素分子中都有有个游离羧基和酰胺侧链。基和酰胺侧链。 母核（母核（6-氨基青霉烷酸）氨基青霉烷酸） 青霉素类青霉素类 头孢菌素类头孢菌素类7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）RCOAB2.性质性质（1）-内酰胺环的不稳定性内酰胺环的不稳定性：四元环张力大，酰胺：四元环张力大，酰胺键易水解。干燥条件：稳定；水溶液：不稳定键易水解。干燥

9、条件：稳定；水溶液：不稳定（2）旋光性旋光性：手性：手性C。青霉素类。青霉素类C 、C 、C 。 头孢菌素类头孢菌素类C 、C 。（3）酸性和溶解性酸性和溶解性：游离羧基。：游离羧基。 与有机碱成盐与有机碱成盐 难溶于水难溶于水 ，与碱金属成盐，与碱金属成盐 易溶于水。易溶于水。（4）紫外吸收特性紫外吸收特性：共轭系统：共轭系统青霉素的降解反应青霉素的降解反应头孢菌素类头孢菌素类酸、碱、胺类酸、碱、胺类 -内酰胺酶内酰胺酶降解降解失效失效二、鉴别试验二、鉴别试验（一）色谱法（一）色谱法 （对照品对照法对照品对照法）（1）TLC法法对照品对照品 相同条件相同条件 比较比较Rf供试品供试品 颜色斑

10、点颜色斑点（2）HLPC法法对照品对照品 相同条件相同条件 比较保留时间比较保留时间供试品供试品 （二）光谱法（二）光谱法1.红外吸收光谱红外吸收光谱IR -内酰胺环羰基内酰胺环羰基 17501800cm-1 仲酰胺的氨基、羰基仲酰胺的氨基、羰基 3300cm-1 1525cm-1 1680cm-1 羧基离子羧基离子 1600cm-1 1410cm-1 以阿莫西林为例以阿莫西林为例2.紫外吸收光谱紫外吸收光谱UV 最大吸收波长最大吸收波长 最大吸收波长的吸光度最大吸收波长的吸光度 如：头孢唑啉钠如：头孢唑啉钠 max=272cm 三、呈色反应三、呈色反应1.异羟肟酸铁反应异羟肟酸铁反应 -内酰

11、胺环破裂内酰胺环破裂 2.类似肽键的反应类似肽键的反应 -CONH- （1）茚三酮反应）茚三酮反应 茚三酮茚三酮-氨基氨基 紫蓝色紫蓝色 （2）双缩脲反应）双缩脲反应 -CONH- 似肽键似肽键 碱性酒石酸铜碱性酒石酸铜-内酰胺类内酰胺类 紫紫 （开环分解）（开环分解）3.其他呈色反应其他呈色反应（1）重氮）重氮-偶合反应偶合反应 重氮苯磺酸试液重氮苯磺酸试液-C6H5-OH 橙黄色橙黄色 （偶合）（偶合）（2）与变色酸）与变色酸-硫酸、硫酸硫酸、硫酸-甲醛等反应甲醛等反应（四）各种盐反应（四）各种盐反应 Na+： 焰色焰色 鲜黄色鲜黄色 加入醋酸氧铀锌加入醋酸氧铀锌 黄色沉淀黄色沉淀K+：

12、焰色焰色 紫色紫色 加入加入0.1%四苯硼钠四苯硼钠+醋酸醋酸 白色沉白色沉 淀淀三、检查三、检查（一）聚合物（一）聚合物 分子排阻色谱法分子排阻色谱法 定量方法：主成分自身对照法定量方法：主成分自身对照法 面积归一化面积归一化 限量法限量法 自身对照外标法自身对照外标法例：青霉素例：青霉素V钾中青霉素钾中青霉素V聚合物的测定聚合物的测定 固定相：葡聚糖凝胶固定相：葡聚糖凝胶G-10（ 40120m ） 流动相流动相A：0.01mol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 流动相流动相B：水：水 对照品溶液：头孢他啶对照对照品溶液：头孢他啶对照 100g/ml200g/ml 1）系统适用性试验：理论塔板

13、数用）系统适用性试验：理论塔板数用1mg/ml蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖2000计算均不低于计算均不低于400；重复性用对照品溶液、流动相；重复性用对照品溶液、流动相B测定。测定。保留时间生物比值均在保留时间生物比值均在1.931.07之间，之间， 拖尾因子均小于拖尾因子均小于2.0，峰面积的，峰面积的RSD应小于应小于5.0%。2）测定方法）测定方法 进样供试液，用流动相进样供试液，用流动相A；进样对照液，用流动相；进样对照液，用流动相B。以。以外标法计算，含青霉素外标法计算，含青霉素V聚合物以青霉素聚合物以青霉素V计不得超过计不得超过0.3%（二）有关物质和异构体（二）有关物质和异构体 例：头孢

14、呋辛酯中有关物质和异构体的检查例：头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查 固定相：固定相：ODS 流动相：流动相：0.2mol/L磷酸二氢铵磷酸二氢铵-甲醇（甲醇（62:38） 检测波长：检测波长：278nm 1）头孢呋辛酯）头孢呋辛酯2-异构体的制备：头孢呋辛酯对异构体的制备：头孢呋辛酯对 照品照品+流动相流动相 头孢呋辛酯头孢呋辛酯2-异构体。异构体。2）系统适用性试验：各异构体之间的）系统适用性试验：各异构体之间的R1.5，以，以 头孢呋辛酯头孢呋辛酯A异构体计算异构体计算n1500。3 3）异构体：）异构体： ttR1R1 相对保留时间相对保留时间 r r1212=- 1-=- 1-被测物

15、被测物 ttR2 R2 2-2-标准标准物物异构体异构体 相对保留时间相对保留时间 判断判断B B异构体异构体 0.85 0.85 供试液谱图中供试液谱图中A A异构体的异构体的峰面积峰面积A A异构体异构体 1.0 1.0 与与A A、B B异构体峰面积和异构体峰面积和之比应之比应 为为0.0.480.55.55。 （三）吸光度（三）吸光度 杂志吸光度方法杂志吸光度方法（四）有机溶（四）有机溶（五）结晶性（五）结晶性 结晶质和非结晶质结晶质和非结晶质 第一法（偏光显微镜法）第一法（偏光显微镜法） 第二法（第二法（X射线粉末衍射法）射线粉末衍射法）四、含量测定四、含量测定（一）高效液相色谱法一

16、）高效液相色谱法 ChP 内标法校正因子内标法校正因子 外标法外标法特点特点 快速、高效、灵敏快速、高效、灵敏 专属性强、重现性好专属性强、重现性好 一法多用（鉴别、检查、含测）一法多用（鉴别、检查、含测） 例：头孢克洛例：头孢克洛 阿莫西林克拉维酸钾分散片阿莫西林克拉维酸钾分散片eg Chpeg Chp头孢克洛含量的头孢克洛含量的HPLCHPLC测定法测定法色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸二氢钾溶液烷键合硅胶为填充剂，以磷酸二氢钾溶液- -乙腈（乙腈（92:892:8）为流动相，检测波长为）为流动相，检测波长为254nm2

17、54nm。取头孢克洛对照品及头孢头孢克洛取头孢克洛对照品及头孢头孢克洛-3-3-异异构体对照品适量，加流动相溶解并稀释制构体对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每成每1ml1ml中分别含头孢克洛及头孢克洛中分别含头孢克洛及头孢克洛-3-3-异构体约异构体约0.2mg0.2mg的混合溶液，取的混合溶液，取20ul20ul注入注入液相色谱仪，记录色谱图，头孢克洛峰与液相色谱仪，记录色谱图，头孢克洛峰与头孢克洛头孢克洛-3-3-异构体峰的分离度应符合要异构体峰的分离度应符合要求。求。 测定法：取本品约测定法：取本品约20mg，精密称定，置，精密称定，置100ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻容量瓶中

18、，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，取度，摇匀，取20ul注入液相色谱仪，记录注入液相色谱仪，记录色谱图；另取头孢克洛对照品适量，同法色谱图；另取头孢克洛对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算出供试品中测定。按外标法以峰面积计算出供试品中C15H14ClN3O4S的含量。规定按无水物计算，的含量。规定按无水物计算，含含C15H14ClN3O4S不得少于不得少于95.0%。（二）生物样品中（二）生物样品中-内酰胺类抗生素的分析内酰胺类抗生素的分析色谱法、微生物法、放射免疫法、色谱法、微生物法、放射免疫法、HPLC法法第三节第三节 氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素苷苷苷苷元元糖糖缩缩合合 氨基糖

19、苷氨基糖苷苷元苷元氨基糖氨基糖缩合缩合 链霉素链霉素 双氢链霉素双氢链霉素新霉素新霉素 卡那霉素卡那霉素庆大霉素庆大霉素 巴龙霉素巴龙霉素一、化学结构和性质一、化学结构和性质（一）化学结构一）化学结构链霉胍链霉胍 + 链霉糖链霉糖 + N-甲基甲基-L-葡萄糖胺葡萄糖胺苷元苷元链霉双糖胺链霉双糖胺糖糖NH CNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHCH3链霉胍链霉胍链霉糖链霉糖N-甲基甲基-L-葡萄糖胺葡萄糖胺巴龙霉素巴龙霉素D-D-葡萄糖胺葡萄糖胺+ +脱氧链霉胺脱氧链霉胺+D-+D-核糖核糖+ +巴龙霉糖巴龙霉糖巴龙胺巴龙胺苷元苷元巴龙二糖胺巴龙

20、二糖胺 糖糖 D-D-葡萄糖胺葡萄糖胺脱氧链霉胺脱氧链霉胺D-D-核糖核糖巴龙霉糖巴龙霉糖OOOOHOCH2OHHONH2HOOOHNH2NH2OHOOHR2NH2CH2OH*R1庆大霉素庆大霉素 糖糖 苷元苷元绛红糖胺绛红糖胺 + 脱氧链霉胺脱氧链霉胺 + 加洛糖胺加洛糖胺 糖糖 ROC R1R2HNNH2OOHH2NNH2OOOHNHCH3OHCH3绛红糖胺绛红糖胺紫素胺紫素胺2-脱氧链霉胺脱氧链霉胺加洛糖胺加洛糖胺N-甲基甲基-3-去氧去氧-4-甲甲基戊糖胺基戊糖胺庆大霉素庆大霉素C复合物复合物 庆大霉素庆大霉素C1 R=H R1、R2=CH3 庆大霉素庆大霉素C2 R=R2=H R1=

21、CH3 庆大霉素庆大霉素C1a R、R1、R2=H 庆大霉素庆大霉素C2a R=CH3 R1= R2=H 庆大霉素庆大霉素C2b R=R1=H R2=CH3（二）（二） 性质性质多与硫酸成盐多与硫酸成盐链霉素链霉素 3 3个个庆大霉素庆大霉素 5 5个个碱性中心碱性中心碱性碱性1.水溶性水溶性溶解性溶解性（二）（二）2.旋光性旋光性 多个氨基糖多个氨基糖3.苷的水解与稳定性苷的水解与稳定性 水解为一分子苷元和一水解为一分子苷元和一分子双键。分子双键。稳定：链霉素 pH57.5 庆大霉素 pH212 4.紫外吸收光谱 二二、 鉴别鉴别 茚三酮反应茚三酮反应（一一）蓝蓝紫紫色色庆庆大大霉霉素素链链

22、霉霉素素茚茚三三酮酮羟基胺结构羟基胺结构 Molisch 试验试验（二二）氨基糖苷类氨基糖苷类H+ 糠醛糠醛羟甲基糠醛羟甲基糠醛 -萘酚萘酚 蒽酮蒽酮呈色呈色1.-萘酚呈色原理萘酚呈色原理2.蒽酮的呈色原理蒽酮的呈色原理（三）（三）N-N-甲基葡萄糖胺反应甲基葡萄糖胺反应例：取本品约例：取本品约10mg,10mg,加水加水1ml,1ml,溶解后溶解后, ,加盐酸溶液加盐酸溶液（91009100）2ml,2ml,在水浴中加热在水浴中加热10min,10min,加加8%8%氢氧化钠氢氧化钠溶液溶液2ml2ml与与2%2%乙酰丙酮水溶液乙酰丙酮水溶液1ml,1ml,置水浴中加热置水浴中加热5min,

23、5min,冷却后，加对二甲基苯甲醛试液冷却后，加对二甲基苯甲醛试液1ml,1ml,即呈樱即呈樱桃红色。桃红色。 （四）麦芽酚反应（四）麦芽酚反应 链霉素的特征反应链霉素的特征反应例例 硫酸链霉素的麦芽酚反应鉴别：取本品约硫酸链霉素的麦芽酚反应鉴别：取本品约20mg,20mg,加水加水5ml5ml溶解后溶解后, ,加氢氧化钠试液加氢氧化钠试液0.3ml,0.3ml,置水浴上置水浴上加热加热5min,5min,加硫酸铁铵（取硫酸铁铵加硫酸铁铵（取硫酸铁铵0.1g,0.1g,加加0.5mol/L0.5mol/L硫酸溶液硫酸溶液5ml5ml溶解）溶解）0.5ml,0.5ml,即成紫红色。即成紫红色。（

24、五）坂口反应五）坂口反应 链霉素水解产物链霉胍的专属反应链霉素水解产物链霉胍的专属反应（六）硫酸盐反应（六）硫酸盐反应（七）色谱法（七）色谱法1.TLC1.TLC Chp2010 Chp2010采用采用TLCTLC法对本类抗生素进行鉴别。法对本类抗生素进行鉴别。薄层板：硅胶薄层板：硅胶G G展开剂：三氯甲烷展开剂：三氯甲烷- -甲醇甲醇- -浓氨水浓氨水显色剂：茚三酮或碘蒸气显色剂：茚三酮或碘蒸气例例: : 硫酸庆大霉素注射液硫酸庆大霉素注射液 取本品与庆大霉素标准品，分别加水制成每取本品与庆大霉素标准品，分别加水制成每1ml1ml中含中含2.5mg2.5mg的溶液，作为供试品溶液和标准品溶液

25、，照的溶液，作为供试品溶液和标准品溶液，照TLCTLC试验，吸试验，吸取上述两种溶液各取上述两种溶液各20ul,20ul,分别点于同一硅胶分别点于同一硅胶G G薄层板（临用薄层板（临用前于前于105105活化活化2h2h）上；另取三氯甲烷）上；另取三氯甲烷- -甲醇甲醇- -氨溶液氨溶液（1:1:11:1:1）混合振摇，放置）混合振摇，放置1h,1h,分取下层混合液为展开剂，分取下层混合液为展开剂，展开，取出于展开，取出于202025晾干置碘蒸气中显色，供试品溶液晾干置碘蒸气中显色，供试品溶液所显主斑点数、位置和颜色应与标准品溶液斑点数、位置所显主斑点数、位置和颜色应与标准品溶液斑点数、位置和

26、颜色相同。和颜色相同。 2.HPLC 通过比较供试品溶液和对照品溶液的色谱通过比较供试品溶液和对照品溶液的色谱图进行鉴别。图进行鉴别。（八）光谱法（八）光谱法1.IR Chp和和Bp均采用红外光谱鉴别本类药均采用红外光谱鉴别本类药物物1.UV 本类药物多无紫外吸收，所以较少用。本类药物多无紫外吸收，所以较少用。 三、杂质检查及组分分析三、杂质检查及组分分析（一）链霉素中链霉素（一）链霉素中链霉素B B的检查的检查 （甘露糖链霉素甘露糖链霉素）1.1.来源来源 发酵时菌种产生发酵时菌种产生2.2.效价效价 链霉素的链霉素的202025%3 3方法方法 TLCTLC（甘露糖对照品法）（甘露糖对照品法）例例 供试品溶液：取本品供试品溶液：取本品0.2g,0.2g,精密称定精密称定, ,置回流用圆置回流用圆底烧瓶中，加入新鲜配制的硫酸底烧瓶中，加入新鲜配制的硫酸- -甲醇溶