变性高效液相色谱原理

1、高效液相色谱原理 DHPLC变性高效液相色谱技术是近年来发展起来的一项新的分析技术，它是分离核苷酸片段及分析检测已知未知基因突变和SNP的最佳技术平台，其核心技术采用Transgenomic公司专利技术的DNA SepCartridge分离柱。DHPLC能够分析检测已知未知突变和SNP，技术关键是依靠这样专利技术的分离系统，在专利技术的DNA SepCartridge分离柱中的基质为聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）交联聚合物微球体，固定相为碳-18烷烃链，PS-DVB微球体与碳-18烷烃链之间形成碳碳共价键共同组成柱填料，填料是电中性、疏水性的，不易与核酸发生反应。三乙基铵醋酸盐（TEAA

2、）是一种离子对试剂，离子对试剂既是疏水性的又带正电荷，既能与核酸主链上的磷酸基团的负电荷反应，同时TEAA的疏水基团又与固定相碳-18链的疏水基团发生反应。这种离子对试剂是连接核酸和柱基质之间的桥梁，因此，它作为“桥分子”使DNA片段吸附在固定相上面。通过改变流动相中乙氰及离子对试剂的浓度实现DNA片段的分离。WAVE® DHPLC分离系统的三种操作模式： WAVE®系统是一套经济、高效及多用途的仪器。标准WAVE系统提供可选择的冷却设备、双板自动进样器、柱箱、紫外检测器和分离柱组成。这套系统可在同一分析标准下实现三种模式的运行。将标准WAVE系统加工和升级可以进一步提升系

3、统的可用性。 执行模式 温度 应用 分离基础 非变性 50 测量双螺旋DNA的大小（小于2000bp）   依赖大小                       PCR质量检测及纯化 依赖序列                

4、60;      定量分析 部分变性 52-75 变性检测 依赖大小 （平均范围） 单核酸多态性检测 依赖序列 完全变性 75-80 测量双螺旋DNA大小（小于2000bp） 依赖大小 （平均范围） DNA分析（DNA SepR柱） 依赖序列 寡核苷酸质量（DNA SepR柱和OLIGO SepR柱）和纯度分析（片段收集器） 大量纯化需要OLIGOSepPrepTMHC柱 非变性条件：依赖分子量的分离 WAVEMAKERTM软件能根据DNA片段分子量大小最大限度完善分离条件。在这些条件下，序列顺序并非是决定DNA洗脱方式的因素。系统在50运行，

5、碱基对的数量决定洗脱顺序。这种应用在非变性条件下能将染色体插入和缺失片段分开。一般说来，产物分子量的1%大小的片段能够被分离。例如，100bp的产物能和101bp的产物分开，300bp的产物能和303bp的产物分开。分子量较小的核酸片段含有相应较少的磷酸盐基团结合柱基质，而分子量较大的片段则含有较多的磷酸盐基团结合柱基质。因此，当我们将过柱的乙腈浓度提高，核酸片段就会根据分子量从小到大的顺序被洗脱出来。在不包括柱温度和碱基对序列的影响下，这种柱运行模式已被证明是正确的。对于想用一些已知片段大小的核酸梯度检验其PCR反应的顾客，我们推荐用这种方法。 部分变性条件：根据片段大小，序列和温度的分离

6、WAVEMAKER软件也能预测突变检测的分析条件。在部分变性的条件下，分离不同成分是根据核酸的大小、序列以及分析温度。以下是变性检测技术原理的阐述，以及它是如何应用的。先设计一对PCR引物，使最大不超过600bp的PCR产物覆盖你所感兴趣的序列。然后将PCR样本移入一块96微孔金属板的孔中，登录WAVE系统分析。在这步后，你就不再需要操作员的进一步帮助。在单核苷酸突变或多态性杂交个体中，野生型DNA和突变型DNA的比率是1：1。加热至95，然后慢慢冷却，使PCR产物杂交形成同源双链和异源双链的混合。在分析含有两个等位基因（纯合突变）的DNA时，这种方法需要稍微修改一些。覆盖纯合突变点的PCR产

7、物与野生型扩增DNA混合并杂交。在这步骤后，样本包括异源和同源双螺旋的混合物。 WAVE的分析系统在能在足以使DNA异源双链变性（融解）的温度下运行。融解的异源双链在离子对反相液相色谱层析与相应的同源双链分离。这个过程也称为温度调控的异源双链层析或分析。在DNASep柱基质中的精确保留时间使得对单核苷酸多态性（SNP）和短串联重复序列（STRs）的高灵敏、快速检测成为可能。在这里我们应用的一个范例是位于基因座位DYS271上，位点168的核苷酸发生从腺嘌呤到鸟嘌呤的突变。图4-5显示了运用WAVE系统在一定范围温度变化下四种相应的杂交产物。在用于测定DNA片段大小的非变性条件下（50），所有四

8、种杂交产物都有着相同的保留时间。当温度上升到54时，异源双链复制物开始在错配碱基两侧区域变性。这种变性导致PCR产物的双链比例减少。在洗脱温度下，单链DNA片段比双链片段更早洗脱。这主要是因为在单链片段分子的负电荷与双链相比较少。因此，异源双链PCR产物比同源双链含有更高的单链的比例，保留时间更短。当同源双链DNA还尚未变性时，异源双链已经被洗脱出来了。在55，同源双螺旋开始变性，野生型腺嘌呤-胸腺嘧啶比突变型胞嘧啶-鸟嘌呤型同源双链变性更快一些。最佳分离温度设为56。两种异源双螺旋并没有必要完全分开，因为所感兴趣的样本序列和野生型对照之间的区别表明DNA序列差异的存在。分辨率是依赖于突变位点，片段长度以及序列的具体构象的。 完全变性条件： 根据片段大小和序列的单链分析 单核苷酸和RNA都需要在完全变