癌基因C-K-ras和抑癌基因Rb突变与胰腺癌发生的关系

1、癌基因C-K-ras和抑癌基因Rb突变与胰腺癌发生的关系 11-01-20 15:37:00 编辑：studa20 作者：关泽红 刘旭东 刘淑萍 云志厚 孟化 张建宇 姜彩虹【摘要】 目的：探讨癌基因C-K-ras和抑癌基因Rb点突变与胰腺癌发生的关系。方法：选择经病理学证实的原发性胰腺癌19例、胰腺癌恶性淋巴瘤1例、胰腺多形细胞癌2例和慢性胰腺炎5例的石蜡包埋组织样本,采用PCR-SSP法检测C-K-ras 12位密码子和Rb第21位外显子的点突变情况。结果：19例原发性胰腺癌石蜡包埋块样本中有7例C-K-ras 12密码子发生了点突变，占36.8%，其中1例为两种突变形式（GAT、GTT）

2、；有9例Rb第21位外显子发生了点突变，占47.3%；而在胰腺癌恶性淋巴瘤、胰腺多形细胞癌和慢性胰腺炎样本中均未检出上述突变情况。结论：C-K-ras 12位密码子和Rb第21外显子点突变与胰腺癌的发生有一定的相关性。 【关键词】 胰腺癌；癌基因C-K-ras；抑癌基因Rb；点突变 Abstract Objectives: To study the correspondence of point mutation of oncogene C-K-ras and antioncogene Rbwith the occurrence of pancreatic carcinomas. Method

3、s: The point mutation of C-K-ras at 12 codon and Rb at 21thexon were detected by PCR-SSP in the araffin embedding samples of 19 cases of pancreatic carcinomas ,1 case ofpancreatic lymphoma , 2 cases of pancreatic polymorphous cell carcinomas and 5 cases of cronic pancreatitis.Results: C-K-ras mutati

4、on at 12 codon were detected in 7 cases of the 19 pancreatic carcinoma samples (37%), oneof which displayed two kinds of mutation (GAT and GTT); Of 19 cases of pancreatic carcinomas,9 cases were detectedwith mutation of Rb 21th exon (47.4%); No mutation in C-K-ras 12th codon and Rb 12 exon were dete

5、cted in cronicpancreatitis，pancreatic lymphoma and pancreatic polymorphous cell carcinomas samples. Conclusion: There is somecorrespondence of point mutation of oncogene C-K-ras and antioncogene Rb with the occurrence of pancreaticcarcinomas. Key words Pancreatic carcinomas;Antioncogene; Rb; Oncogen

6、e; C-K-ras ; Point mutation 胰腺癌(Pancreatic Carcinoma)是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一。它的发病率在西方国家的过去30年间增加了3倍1，中国增长了6倍2。由于其发病隐匿，尚缺早期诊断手段，一经确诊常常已到晚期，错过了最佳治疗时期，致使预后极差，五年生存率不足2%。随着分子医学与分子生物学的发展及许多新技术新方法的应用，逐步揭示了许多疾病的发生与基因突变或表达异常有关。目前比较一致的看法认为，肿瘤的发生是由于细胞生长调控机制紊乱造成的。正常细胞的增殖分化是由两大类基因调控的，一类是正调控信号，促进细胞的生长和增殖，并且阻止其向终末分化，现知多数

7、癌基因起这一作用；另一类是负调控信号，促进细胞成熟，向终末分化，最后凋亡，现知抑制癌基因可能发挥这方面的作用。正常情况下，这两种信号保持动态平衡，对细胞生长、增殖和凋亡进行精确的调控。一旦两者之间平衡被破坏，如癌基因激活或抑癌基因失活，必将导致细胞增殖紊乱而发生癌变。近年来的研究表明，癌基因或抑癌基因突变是细胞癌变的关键性因素，可望成为癌症早期诊断的重要指标。本文通过检测胰腺癌组织中癌基因C-K-ras和抑癌基因Rb的点突变情况，研究胰腺癌发生的分子机理，分析癌基因C-K-ras和抑癌基因Rb的点突变作为胰腺癌早期诊断的可能性。1 材料与方法1.1 材料45例标本来自呼和浩特地区内蒙古医学院和

8、内蒙古医院病理科，所有标本均经10%福尔马林固定、石蜡包埋，病理组织学证实为胰腺癌，其中胰腺癌37例，胰腺恶性淋巴瘤1例，胰腺多形细胞癌2例，慢性胰腺炎5例。1.2 主要仪器试剂台式高速离心机，TGL，上海制造；水平式电泳槽，DYY-31B，北京制造；微电脑DNA扩增仪，1109型，北京制造；PCR试剂盒和标准DNA Marker，华美生物工程公司北京分公司；Rb基因PCR引物由上海生物工程有限公司合成；C-K-ras基因PCR引物由华美生物工程公司北京分公司合成；其它试剂均为分析纯，国内生产。1.3 方法石蜡包埋组织中DNA模板的提取3：每份标本切5m厚切片，苏木素-伊红（Hematoxyl

9、in-Eosin,HE）染色后经光学显微镜下鉴定组织。另连续切4片，置2mL无菌Eppendorf试管分装。脱蜡：每管加二甲苯1 000L,溶解30min,14 000rpm离心5min,弃上清；沉淀中加二甲苯1 000L,溶解30min,离心5min,弃上清；加无水乙醇1 000L,翻转混匀2min,离心5min,弃上清；加无水乙醇1000L,再翻转混匀2min,离心5min,弃上清；加75%乙醇1 000L,翻转混匀2min,离心5min,弃上清；加丙酮500L,翻转混匀2min,离心5min,弃上清；置55水浴干燥5min。消化：每管加Lysis Buffer（含蛋白K）200L,置55

10、水浴2h,95水浴灭活蛋白酶10min,置-20保存做PCR模板。 PCR扩增4：30L反应体系中含20buffer 1.5L，1.7mmol/L MgCl 1.8L,各200mol/L的四种dNTP .3L,0.5mmol/L的引物各0.2L，模板4L，Taq DNA聚合酶1.52U,双蒸水补到30L。反应步骤：94预变性300s,然后进入循环，94变性45s,55退火45s,75延伸45s,共进行35个循环。最后72延伸300s。 PCR产物的鉴定：在30L扩增产物中加入0.25%溴酚兰和0.25二甲苯菁一滴，在含有10mg/mL溴化乙碇的3%琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1TBE,电压100V,电流10mA/cm2,时间3040min。电泳结束后紫外灯下观察结果。2 结果 37例胰腺癌中有19例提取到完整DNA，占51.3%（19/37）。其余由于标本存放时间长和DNA提取时造成基因断裂。在提出的19份DNA中，C-K-ras基因12位密码子突变的7例，占36.8%（7/19），总突变方式8，其中两种突变的1例（GAT，GTT）占12.5%（1/8），GGT 1例占12.5%（1/8），GTT 3