2015第六章常用分子生物学技术的原理及其应用

1、目录目录常用分子生物学技术的原理常用分子生物学技术的原理及应用及应用金晶金晶 中山大学药学院中山大学药学院第六章第六章目录目录第一节第一节分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Technique目录目录 利用单链核酸碱基互补配对、抗原与抗利用单链核酸碱基互补配对、抗原与抗体、受体与配体、蛋白与其他分子的相体、受体与配体、蛋白与其他分子的相互作用进行目的核酸、蛋白质检测，广互作用进行目的核酸、蛋白质检测，广泛应用于基因重组、生物印迹示踪、生泛应用于基因重组、生物印迹示踪、生物芯片等领域，具有高特异性、高灵敏物芯片等领域，具有

2、高特异性、高灵敏度、高通量等特点的技术。度、高通量等特点的技术。目录目录（一）核酸分子杂交（一）核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在在DNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNA单链分子单链分子放在同一溶液中，或把放在同一溶液中，或把DNA与与RNA放在一起，放在一起，只要在只要在DNA或或RNA的单链分子之间有一定的碱的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链化双链(heteroduplex) 。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理目录目录目录目录目录目录

3、 高温高温 酸酸 碱碱 有机溶剂有机溶剂: :乙醇、尿素、甲酰胺等乙醇、尿素、甲酰胺等 DNADNA变性后物理性质发生了变化：变性后物理性质发生了变化： 粘度下降，沉降速度增加粘度下降，沉降速度增加 提高了对紫外线的吸收能力：增色效应提高了对紫外线的吸收能力：增色效应目录目录 游离碱基或核苷酸的游离碱基或核苷酸的A260: 1.60 单链单链DNA的的A260: 1.37 双链双链DNA的的A260：1.0 （浓度为（浓度为50g/mL时测定）时测定）目录目录 增色效应：增色效应： 指变性后指变性后DNADNA溶液的紫外吸收作用增强溶液的紫外吸收作用增强的效应。的效应。 产生增色效应的原因：产

4、生增色效应的原因： DNADNA分子中碱基间电子的相互作用使分子中碱基间电子的相互作用使DNADNA分子具有吸收分子具有吸收260nm260nm波长紫外光的波长紫外光的特性。在特性。在DNADNA双螺旋结构中碱基藏入内双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时侧，变性时DNADNA双螺旋解开，于是碱基双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。于紫外吸收，故而产生增色效应。 目录目录 A260/A280反映核酸的纯度反映核酸的纯度 纯纯DNA：比值为：比值为1.8, (实验时实验时1.6比值比值1.9) 纯纯RNA：比值为：比值为2.

5、0，(实验时实验时1.7比值比值2.0)目录目录 Tm（melting temperature ）：解链温度，）：解链温度，A260升高到一半时的温度。升高到一半时的温度。 生理条件下生理条件下Tm一般为一般为8595之间。之间。目录目录目录目录目录目录复性复性RNADNA目录目录（二）印迹技术（二）印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到转移到NCNC等各种膜上，使之成为固相化分子。等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为此称之为“blotting”“blot

6、ting”，译为印迹技术。，译为印迹技术。 目录目录用放射性核素、生物素或荧光染料标记其用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针探针”，探针可以与固定在，探针可以与固定在NCNC膜上的核苷膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 （三）探针技术（三）探针技术目录目录二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹印迹 (Southern Blotting)（二）（二）RNA印迹印迹 (Northern Blotting)（三）蛋白质的印迹（三）蛋

7、白质的印迹 (Western Blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。目录目录n其他：其他：n斑点印迹斑点印迹 (dot blotting) n原位杂交原位杂交 (in situ hybridization)nDNA点阵点阵 (DNA array) nDNA芯片技术芯片技术 (DNA chip)三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较分子杂交实验分子杂交实验目录目录放放射射自自显显影影照照片片目录目录v 定义：在斑点杂交基础上，

8、模拟制备大规模集成电路定义：在斑点杂交基础上，模拟制备大规模集成电路的基本原理，集成了探针原位合成、照明平板印刷、的基本原理，集成了探针原位合成、照明平板印刷、精密控制、激光共聚焦显微技术发展来的一门分子生精密控制、激光共聚焦显微技术发展来的一门分子生物学技术物学技术 v 原理：将大量样本固定于较小的支持物上，然后与标原理：将大量样本固定于较小的支持物上，然后与标记好的待测样品杂交，再检测杂交信号的强弱，从而记好的待测样品杂交，再检测杂交信号的强弱，从而判断样本中待测判断样本中待测DNADNA、RNARNA、PrPr等分子数量或活性状态等分子数量或活性状态v 特点：高通量、微型化、集约化、标准

9、化等特点：高通量、微型化、集约化、标准化等目录目录DNA芯片芯片(DNA chip) cDNA芯片芯片(cDNA chip)是指将许多特定的是指将许多特定的DNA片段或片段或cDNA片段作片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上的支持物上 。目录目录 基因芯片基因芯片(Gene chip)技术是指技术是指: 通过微阵列通过微阵列(Microarray)技术将高密度技术将高密度DNA片片段阵列通过高速机器人或原位合成方式段阵列通过高速机器人或原位合成方式 以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，

10、片等固相表面， 以荧光标记的以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交探针，借助碱基互补杂交原理，原理， 进行大量的基因表达及监测等方面研究的最进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术新革命性技术目录目录v基因表达水平的检测基因表达水平的检测 v基因诊断基因诊断v药物筛选药物筛选v个体化医疗个体化医疗v测序测序v生物信息学研究生物信息学研究目录目录目录目录DNA点阵点阵目录目录第二节第二节聚合酶链反应聚合酶链反应Polymerase Chain Reaction目录目录目录目录PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCT

11、AGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长目录目录PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物目录目录PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延

12、长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶目录目录PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明 1971年，年，Khorana提出：经过提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用变性，与合适引物杂交，用DNA聚聚合酶延伸引物，并不断重复该过程合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆便可克隆tRNA基因。基因。 但由于测序和引物合成的困难，以但由于测序和引物合成的困难，以及及70年代基因工程技术的发明使克年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，隆基因成为可能，所以，Khora

13、na的设想被人们遗忘了的设想被人们遗忘了目录目录PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国年，美国PE-Cetus公司的公司的Mullis等人等人发明了聚合酶链反应（发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制复制最初采用最初采用E-coli DNA聚合酶进行聚合酶进行PCR，由，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错易出错耐热耐热DNA聚合酶的应用使得聚合酶的应用使得PCR能高效率能高效率的进行，随后的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台公司推出了第一

14、台PCR自动化热循环仪自动化热循环仪1993年，年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学等因此项技术获诺贝尔化学奖奖目录目录 目录目录目录目录目录目录XX延伸目录目录目录目录40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20目录目录目录目录PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0.1 0.12ug2ugTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2.5u 2.5uMg2

15、+ Mg2+ 1.5mmol/L1.5mmol/L目录目录1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍目录目录PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95目录目录PCR反应条件PCR

16、过程PCR的特点9550引物1引物2DNA引物目录目录PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶目录目录PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束95第2轮开始目录目录PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaq目录目录PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束目录目录PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增目录目录PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高灵敏度高皮克皮克(pg=10-12)(pg=10-12)量级扩增到微克量

17、级扩增到微克(ug=10-6)(ug=10-6)水平水平能从能从100100万个细胞中检出一个靶细万个细胞中检出一个靶细胞胞病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达3 3个个RFURFU细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为3 3个细菌个细菌简便、快速简便、快速一次性加好反应液，一次性加好反应液，2 24 4 小时完小时完成扩增成扩增扩增产物一般用电泳分析扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提细胞、活组织等组织的粗提DNADNA目录目录目录目录3目录目录目录目录目录目录目录目录 Mg2+是

18、是DNA聚合酶的激活剂。聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。反应体系。Mg2+浓度过低会使浓度过低会使Taq酶活性丧失、酶活性丧失、PCR产产量下降；量下降； Mg2+过高影响反应特异性。过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。浓度。目录目录目录目录目录目录利用特异性引物以利用特异性引物以cDNA或基因组或基因组DNA为模板获为模板获得已知目的基因片段得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的接以

19、组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；为模板获得目的片段；利用简并引物从利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；序列相似的基因片段；利用随机引物从利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆文库或基因组文库中克隆基因。基因。 二、二、PCRPCR技术的主要用途技术的主要用途（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆目录目录利用利用PCRPCR技术可以随意设计引物在体技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。变等改造。 PCR技术高度敏感，对模板技术高度敏感，对模板DNA的的量要求很低，

20、是量要求很低，是DNA和和RNA微量分析的微量分析的最好方法。最好方法。 （三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（二）基因突变（二）基因突变目录目录将将PCRPCR技术引入技术引入DNADNA序列测定，使测序序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；工作大为简化，也提高了测序的速度；待测待测DNADNA片段既可克隆到特定的载体后片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。进行序列测定，也可直接测定。PCR与其他技术的结合可以大大提高基与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性因突变检测的敏感性 。（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突

21、变分析目录目录 逆转录逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将是将RNA的逆转录反应和的逆转录反应和PCR反应联合反应联合应用的一种技术。应用的一种技术。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分进行定性及半定量分析的最有效方法。析的最有效方法。 （一）逆转录（一）逆转录PCR技术技术三、几种重要的三、几种重要的PCRPCR衍生技术衍生技术目录目录 原位原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的上的单个

22、细胞内进行的PCR反应，然后用特异反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或或RNA是否在该组织或细胞中存在。是否在该组织或细胞中存在。 原位原位PCR方法弥补了方法弥补了PCR技术和原位杂交技术技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。一种最佳方法。（二）原位（二）原位PCR技术技术目录目录（三）实时（三）实时PCR技术技术实时实时PCR(real-time PCR)PCR(real-time PCR)技术通过动态监技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对测反应过程

23、中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量定量分析的干扰，亦被称为定量PCRPCR。 目录目录n实时实时PCRPCR技术原理技术原理QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标记引物荧光标记引物RQ 3355目录目录目录目录反义技术：根据碱基互补原理，用人工反义技术：根据碱基互补原理，用人工合成或生物合成的特定互补合成或生物合成的特定互补DNADNA或或RNARNA片片段（或其化学修饰产物）抑制或封闭基段（或其化学修饰产物）抑制或封闭基因表达的技术因表达的技术目录目录 反义核酸：根据碱基互补原则，用人工合反义核酸：根据碱基互补原则，用人工合成或生物合成的特定互补成或生物合成

24、的特定互补DNADNA或或RNARNA片段片段（或其化学修饰产物）（或其化学修饰产物） 这类特异的核酸片段能够与目的序列结合，这类特异的核酸片段能够与目的序列结合，通过空间位阻效应或诱导通过空间位阻效应或诱导RNAaseRNAase活性，在活性，在复制、转录、剪接、复制、转录、剪接、mRNAmRNA转运及翻译水平，转运及翻译水平，抑制或封闭目的基因的表达。抑制或封闭目的基因的表达。目录目录目录目录目录目录2006年的诺贝尔生理学奖获得者：年的诺贝尔生理学奖获得者：Andrew Z. FireCraig C. Mello目录目录一些小的双链一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体可以高效、特异地阻断体内特定基因表达内特定基因表达,促使促使mRNA降解降解,诱使细胞表诱使细胞表现出特定基因缺失的表型现出特定基因缺失的表型,称为称为RNA干扰干扰(RNA interference, RNAi,也译作也译作RNA干预或干预或者干涉者干涉)。目录目录The appearance of dsRNA triggers the RNAi response:first by attraction of RNA nuclease-cleaves the RNA into short pieces; these can then be amplified by RNA-d