植物组织培养技术绪论讲义

1、绪论 引言：植物组织培养是20世纪初开始，以植物生理学为基础，在植物细胞全能性(totipotency )理论的指导下，特别是对植物生长调节剂(growth regulator)的应用而发展起来的一项技术。经过各国科学家100多年的辛勤探索，现在可以说几乎所有的植物，其器官、组织或细胞都能离体培养成功。大多数还能从细胞的一部分，甚至没有细胞壁的裸露的原生质体中，再生出无数的小植株。 近40多年来，植物组织培养技术已渗透到生物学科的各个领域，成为生物学科研究的重要技术手段，并在农业、林业、工业、医药业等行业中被广泛应用，产生了巨大的经济效益和社会效益，成为了举世瞩目的生物技术之一。那么，什么是植

2、物组织培养呢？1. 植物组织培养的概念和种类1.1 植物组织培养的概念植物组织培养的概念有广义和狭义之分。广义的植物组织培养（plant tissue culture ）是指在无菌和人工预知的控制条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织或细胞进行离体培养，使其再生细胞或生长、分化成完整植株的技术。植物组织培养概念中所提到的无菌(asepsis)是指使培养器皿、器械、培养基和培养材料等处于无真菌、细菌、病毒等微生物的状态，以保证培养材料在培养器皿中正常生长和发育。人工控制的环境条件是指对光照、温度、湿度、气体等条件进行人工控制，以满足植物培养材料在离体条件下的正常生长和发育。适当的培养基

3、是指培养基含有适当营养物质和植物生长调节物质等。2 / 41植物组织培养中，使用的各种器官、组织和细胞统称为外植体(explant)。在植物组织培养中，由于培养的植物材料已脱离了母体，故植物组织培养又称为植物离体培养(plant culture in vitro)。对离体培养环境条件控制的研究内容被称为离体生态学(in vitro ecology)，其构成是培养基、植物材料和人工环境条件。狭义的植物组织培养仅指对植物的组织（如分生组织、表皮组织、薄壁组织等）及培养产生的愈伤组织（callus）进行离体培养的技术。所谓愈伤组织是指外植体因受伤或在离体培养时，其未分化的细胞和已分化的细胞进行活跃的

4、分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织。目前我们一般所说的植物组织培养是指广义的植物组织培养，而最初则指狭义的植物组织培养。1.2 植物组织培养的种类植物组织培养最初是指愈伤组织培养。Gamborg曾根据所培养的植物材料的不同，把组织培养分为5种类型，即愈伤组织培养、悬浮细胞培养、 器官培养(胚、花药、子房、根和茎的培养等)、茎尖分生组织培养和原生质体培养。但发展至今，其范围日益扩大，已包括植物体和它高度组织化的离体器官、组织、复杂的多细胞和原生质体的离体无菌培养。因此，从培养对象上来看，可将其分成以下几种：1.2.1植株的培养（culture of plant） 植株的培养是指将幼苗及较

5、大植物体放在无菌的人工环境中让其生长发育的方法。植株培养一般是作为植物组织培养的中间环节，如再生植株的继代培养、壮苗培养等；也用于植物的种质保存，如某些名、优、新或濒危植物的体外慢生长保存。1.2.2 胚胎培养（embryo culture） 植物胚胎的培养是指将植物成熟或未成熟胚放在离体的、无菌的人工环境中让其生长发育的方法。由于植物的胚是包含在胚珠和子房里，因而进行胚胎培养时，常常是取胚珠和子房放在培养基上，使其内的胚进一步生长发育。胚胎培养的方法也可用于离体受精后形成的杂种胚培养和体细胞诱导出的胚状体培养。1.2.3 器官培养（organ culture ） 植物的器官有两类：营养器官和

6、生殖器官。根、茎、叶是植物的三大营养器官，花、种子、果实是植物的生殖器官。植物器官的培养指的是以植物的根、茎、叶、花、种子、果实等器官的组织切块（切块既可是部分器官，也可是部分组织）为外植体，使之在离体的人工无菌环境中进行生长发育的方法。植物器官培养强调的是外植体的器官类别，培养时可用整体器官，也可用器官切块或切段。不同植物的同一器官有不同的培养结果，同一植株的不同器官也有不同的培养结果。这一点在应用植物组织培养技术时相当重要。1.2.4 组织培养（tissue culture） 植物组织的培养是指将植物体的组织（愈伤组织、分生组织、形成层组织、韧皮韧皮部组织等）或组织切块，放在离体的无菌环境

7、中让其生长发育的方法。由于离体培养的组织块大多是先脱分化形成愈伤组织，而后再进一步生长分化，因此也将植物组织的培养定义为愈伤组织的培养。1.2.5 细胞培养（cell culture）植物细胞的培养是指将植物材料从母体植株上切取后，分离成细胞或小细胞团，放在无菌的人工环境条件下使其生长发育的方法。植物细胞培养强调的培养对象是游离细胞或细胞团，培养时可用一群细胞，也可用单个细胞。1.2.6 原生质体培养（protoplast culture） 植物原生质体的培养是指将植物的细胞去除细胞壁后形成裸露的原生质体，把原生质体放在无菌的人工环境条件下使其生长发育的方法。其中愈伤组织培养是一种最常见的培养

8、形式。愈伤组织培养之所以是一种最常见的培养形式，是因为除茎尖分生组织培养和一部分器官培养以外，其他几种培养形式最终也都要经历愈伤组织才能产生再生植株。此外，愈伤组织还常常是悬浮培养的细胞和原生质体的来源。根据培养过程，将从植物体上分离下来的部分进行第一次培养，称为初代培养（primary culture ），以后将培养物转移到新的培养基上继续培养，则统称为继代培养(subculture)。根据培养基的物理状态，把加入琼脂使培养基呈固体状态的培养，称为固体培养(solid culture )。不加入琼脂而培养基呈流体状态的培养，称为液体培养(liquid culture )。2. 植物组织培养的

9、特点植物组织培养的主要特点是采用微生物学的实验手段来操作植物离体的器官、组织和细胞。这一特点具体表现在以下几个方面：无菌：组织培养的整个过程都是在无菌条件下进行的，外植体、培养基、操作器械、接种环境等都须经过无菌处理。采用人工培养基：组织培养在多数情况下是利用成分完全确定的人工培养基进行的，除少数特殊情况(如进行营养缺陷型突变细胞的筛选)外，培养基中包含了植物生长所需的水分和一切大量元素、微量元素、有机物和植物激素(phytohormone)，培养基的pH和渗透压也是人为设定的。因此，在组织培养中的植物材料不需依靠自身的光合作用制造养分，而是处于完全的异养状态。离体培养：组织培养的起始材料可以

10、是植物的器官、组织，也可以是单个的细胞，它们都处于离体状态下。细胞的全能性不仅表现在二倍体细胞水平上，而且也表现在单倍体细胞(如小孢子)和三倍体细胞(如胚乳)水平上，即使是去掉了细胞壁的细胞(原生质体)，在组织培养条件下也能再生完整植株。连续继代培养：组织培养物通过连续继代培养可以不断增殖，形成克隆(clone，也称无性繁殖系)，或通过改变培养基成分，特别是其中的植物激素的种类和配比，而达到不同的实验目的，如茎芽增殖或生根。 封闭培养：组织培养是在封闭的容器中进行的，容器内气体和环境气体可通过瓶塞或其他封口材料进行交换。容器内的相对湿度在通常情况下几乎是100，因此，组培苗叶片表面一般都无角质

11、层或蜡质层，且气孔保卫细胞功能缺乏，气孔始终都是张开的。人工可控环境条件：组织培养的环境温度、光照强度和时间等都是人为设定的，找出这些物理因素的最适参数对组织培养的成功也很重要。3. 植物组织培养有关的基本概念与基础理论3.1植物细胞全能性植物细胞全能性（totipotency）是植物组织培养的理论基础。大家知道，植物细胞和动物细胞在结构上有若干区别，同样地，它们在生理特性上也不完全一样。动物细胞的分化一般都是不可逆的，植物细胞则不然，只要具有一个完整的膜系统和一个有生命力的核，即使是已经高度成熟和分化的细胞，也还保持着回复到分生状态的能力。 植物细胞全能性是指一个生活的植物细胞，只要有完整的

12、膜系统和细胞核，它就会有一整套发育成一个完整植株的全部遗传信息，在适当的条件下，这些信息可以表达，再生成一个完整植株。但是在自然状态下，由于细胞在植物体内所处位置及生理条件的不同，它的分化受到各方面的调控，致使其所具有的遗传信息不能全部表达出来，所以只能形成某种特化细胞，构成植物体的一种组织或一个器官的一部分。由此可以说明条件是十分重要的，或者说是关键的，只要条件合适，细胞潜在的遗传能力就会表现出来。植物组织和细胞培养技术就是以细胞全能性作为理论依据，用人为的方法创造出一个适合于生长的理想条件，使细胞的全能性得以发挥。 从理论上讲，只要是一个生活的细胞，都有再生出一个完整植株的潜力，但实际情况

13、并非如此简单。就目前所知，细胞的再生潜力与其分化程度呈负相关，就是说细胞分化程度越高其再生能力越低，但也有人认为细胞的再生能力与其分化程度无关，只是人们现在还没能完全掌握细胞分化的机制。虽然还没有完全从理论上揭示其原因，但事实是越老的细胞，其基因的表达就越受到严格的制约，或者说丧失功能或不表现功能的基因越多，所以应尽量选取幼嫩的植物组织作为培养的实验材料。同时，还应该考虑到，一定的基因型或外植体的再生能力并不是一成不变的，在不同培养条件下，同一基因型或外植体的表现不同，高度分化的细胞或组织只要条件合适，也有产生再生植株的可能，这种可能性能否变为现实，还有待于人们继续努力。3.2 细胞分化、脱分

14、化与再分化(cell differentiation，dedifferentiation and redifferentiation)细胞分化(differentiation)是指生物在个体发育过程中细胞由一般变为特殊的现象，即普通形态结构的细胞，向着不同形态结构的方向发展，从而在机能上也各不相同。受精卵经过细胞分裂和分化，引起极性的形成(根端和茎端)，最后发育成种子，这是一种分化。一粒成熟的种子含有一个小小的胚，也可以叫做胚胎。构成胚胎的所有细胞几乎都保持着未分化的状态和旺盛的细胞分裂能力，其细胞质浓稠、细胞核较大、细胞与细胞之间没有很大差异，这些细胞都可以叫做胚性细胞，或叫分生性细胞或未分

15、化细胞。在适宜的条件下，随着种子的萌发，构成胚胎的所有细胞即开始分裂活动，增加细胞数目。随着时间的进行，细胞的命运发生不同变化，形态和功能也发生变化，有的形成了叶子的细胞，有的形成了根的细胞，有的形成茎的细胞，有的仍保持分裂能力，有的则逐渐失去分裂能力，这也是分化。分化主要是由细胞内的基因决定的，分化的结果导致细胞分裂能力的丧失，伴随的是细胞的分化、成熟与组织的形成，是植物根、茎、叶、花、果实和种子的形成，是一个成熟植物体的出现。在正常的自然状态下，这些已经分化的细胞不会再恢复分裂能力重新开始细胞分裂，直到植物体死亡为止。当把一个已经失去了分裂能力，处于分化成熟和分裂静止状态的细胞置于特定的增

16、殖培养基上时，它首先发生的变化是回复到分生性状态，这一状态包括由溶酶体的活动而将失去功能的细胞质组分降解，并产生新的细胞质组分（即细胞器的破坏与重建），同时细胞内酶的种类与活性发生改变，蛋白质合成和细胞代谢过程也发生改变，最后引起基因表达的改变，细胞的性质和状态发生了扭转，可以说是返老还童。由失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成形成一种高度液泡化的呈无定形态的薄壁细胞即愈伤组织的现象（或过程）称为“脱分化”(dedifferentiation)。经过脱分化的细胞如果条件合适，就可以长久保持旺盛的分裂状态而不发生分化。由无分化的愈伤组织的细胞再转变成为具有一定结构，执行一定生理功能

17、的细胞团和组织，进而构成一个完整的植物体或植物器官的现象（或过程），叫做“再分化”(redifferentiation)。一个已分化细胞要表达出其全能性，就要经过脱分化和再分化的过程，这就是植物组织和细胞培养所要达到的目的。因此,设计培养基和创造合适培养条件的主要原则就是如何促使植物组织和细胞完成脱分化和再分化，培养的主要工作就是设计和筛选培养基，探讨和建立合适的培养条件。再分化脱分化分离愈伤组织外植体植物体生长完整植株生长点植物激素在调节细胞脱分化和再分化中起主要作用。植物对激素的反应十分敏感，培养基中生长素类和细胞分裂素类的种类、相对比例和绝对量都能直接影响到细胞脱分化和再分化的过程，组培

18、中常常是通过调节激素的种类、浓度和相对比例来达到调节脱分化和再分化的目的，这个问题将在以下有关章节中进一步介绍。离体器官的分化方式有许多种，比较典型的分化途径有三种(图1)：一是由分生组织直接分生芽；二是由分生组织形成愈伤组织，经过分化实现细胞的全能性；三是游离细胞或原生质体形成胚状体(embryoid)，由胚状体直接重建完整植株，或制成人工种子后再重建植株。图1植物离体组织或器官分化成植株的途径3.3 器官发生和胚状体发生(organogenesis and embryogenesis)培养的植物组织与细胞再经过脱分化和再分化再生出新的植物体过程中，特别是再分化时，可经过两条途径，一是由愈伤

19、组织的部分细胞先分化产生芽（或根），再在另一种培养基上产生根（或芽），形成一个完整的植株，因为芽和根都是植物体的器官，所以这一过程叫器官发生途径。二是在愈伤组织中产生出一些与种子中的胚相似的结构，即同时形成一个有苗端和根端的两极性结构，然后再在另一种培养基上同时发展成带根苗，由于这一过程与种子中胚的形成和种子萌发时形成幼苗的过程相似，所以叫做胚状体发生或无性胚胎发生。组培条件下植物再生是走器官发生途径还是走胚状体途径，随植物不同而不同，也随培养基的不同而变化，有时甚至同一种植物在同一条件下，既存在体细胞胚胎发生途径，也存在器官发生途径，这都是自然现象，是正常的，只是两种发育途径的频率随着基因型

20、不同和培养条件的改变而差异显著。3. 植物组织培养的发展历史植物组织培养技术的整个历史可以追溯到19世纪末和20世纪初。在从那时起到现在的一个世纪中，组织培养的发展过程大致可以分为三个阶段：1.2.1 探索阶段(20世纪初至20世纪30年代中) 植物组织培养的理论基础源于18381839年德国的植物学家TSchleidon和动物学家TSchwann提出的细胞学说(cell theory)。该学说的基本内容是：一切生物都是由细胞构成的，细胞是生物体的基本功能单位，细胞只能由细胞分裂而来。20世纪初，德国植物生理学家Haberlandt首次进行了离体细胞培养的实验，并于1902年发表了植物组织培养

21、的第一篇论文。他是怎么做的呢？20世纪初，在Schleiden和Schwann所发展起来的细胞学说的推动下，德国植物生理学家Haberlandt提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直至分到单个细胞的观点，并设想离体细胞具有再生完整植株的潜力。为了论证这一设想，他在加入了蔗糖的Knop溶液Ca(NO3)2·4H2O0.8g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，KNO30.2g/L，FeSO4 微量，KH2PO40.14g/L中培养单个离体细胞，所选用的材料是小野芝麻和凤眼兰的栅栏组织和虎眼万年青属植物的表皮细胞等。遗憾的是，虽然在栅栏细胞中他明显看到了细胞的生长、细胞壁

22、的加厚和淀粉的形成等，但没有一个细胞在培养中能够发生分裂。Haberlandt实验失败的原因，现在看来主要在于两点：第一，他所选用的实验材料都是已经高度分化了的细胞；第二，所用的培养基过于简单，特别是培养基中没有包含诱导成熟细胞分裂所必需的生长激素，这是因为生长激素在当时还没有发现。虽然如此，但这并不妨碍我们把他看作植物组织培养的先驱。作为植物组织培养的先驱者，Haberlandt的贡献不仅在于首次进行了离体细胞培养的实验，而且在其1902年发表的“植物离体细胞培养实验”的报告中，还提出了胚囊液在组织培养中的作用和看护培养法等科学的预见。自Haberlandt的实验之后，直到1934年Whit

23、e培养番茄离体根尖的成功，在其间的32年时间里，植物组织培养技术在总体上处于探索之中，进展不大，但在以下两个方面取得了有深远意义的结果。一个方面是胚培养的实验。植物胚离体培养的第一个成功例子是1904年E.Hanning报道的。Hanning在无机盐和蔗糖溶液中对萝卜和辣根菜的胚进行了培养，结果发现离体胚可以充分发育成熟，并提早萌发形成小苗。1922年，美国学者Knudson采用胚培养法获得了大量的兰花幼苗，克服了兰花种子发芽困难的问题。后来，Laibach(1925，1929)把由亚麻种间杂交形成的不能成活的种子中的胚剖出，在人工培养基上培养至成熟，从而证明了胚培养在植物远缘杂交中利用的可能

24、性； 另一方面是根培养的实验。有关根培养的最早的研究结果是德国学者Kotte和美国学者Robbins在1922年报道的。他们在含有无机盐、葡萄糖或果糖、多种氨基酸、琼脂的培养基上，进行了豌豆、玉米、棉花1.453.75cm的茎尖和根尖离体培养，形成了缺绿的叶和根，并发现离体培养的组织只能进行有限的生长，未发现培养细胞有形态发生(morphogenesis)能力。1.2.2 奠基阶段（20世纪30年代中至50年代末）到了20世纪30年代中期，植物组织培养领域里出现了两个重要的发现，其一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素是一种天然的生长调节物质。导致这两个发现的主要是Whit

25、e和Gautheret的实验。1934年，White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性系，使根的离体培养实验首次获得了真正的成功。起初，他在实验中使用的培养基包含无机盐、酵母浸出液和蔗糖。后来(1937)，他用3种B族维生素，即吡哆醇(VB6)、硫胺素(VB1)和烟酸(VB5)，取代酵母浸出液获得成功。在这个以后被称为White培养基的合成培养基上，他把某些于1934年建立起来的根培养物一直保存到1968年他逝世前不久。与此同时， Gautheret(1934)在山毛柳和黑杨等形成层组织的培养中发现，虽然在含有葡萄糖和盐酸半胱氨酸的Knop溶液中，这些组织也可以不断增殖几个月，但只有在培养基中

26、加入了B族维生素和IAA以后，山毛柳形成层组织的生长才能显著增加。由于这些实验揭示了B族维生素和生长素的重要意义，又直接导致了1939 年Gautheret连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。同年，White由烟草种间杂种的瘤组织，Nobecourt由胡萝卜，也建立了类似的连续生长的组织培养物。因此，Gautheret、White和Nobecourt一起被誉为植物组织培养的奠基人。我们现在所用的若干培养方法和培养基，原则上都是这三位作者在1939年所建立的方法和培养基演变的结果。不过，虽然连续生长的组织培养是在1939年建立的，但当时这三位作者所使用的组织都包含了分生细胞。诱导成熟和业已分化的

27、细胞发生分裂，则直到后来发现了细胞分裂素之后才成为可能。20世纪40年代和50年代初期，活跃在植物组织培养领域里的研究者以Skoog为代表，研究的主要内容是利用嘌呤类物质处理烟草髓愈伤组织以控制组织的生长和芽的形成。Skoog(1944)以及Skoog和崔瀓等(1951)发现，腺嘌呤或腺苷不但可以促进愈伤组织的生长，而且还能解除培养基中生长素(IAA)对芽形成的抑制作用，诱导芽的形成，从而确定了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。这些实验结果导致了激动素的发现和以后利用激动素和生长素在组织培养中控制器官分化工作的开展。在20世纪40年代，组织培养技术的另一项发展是Overbee

28、k等(1941)首次把椰子汁作为补加物引入到培养基中，使曼陀罗的心形期幼胚能够离体培养至成熟。到20世纪50年代初，由于Steward等在胡萝卜组织培养中也使用了这一物质，从而使椰子汁在组织培养的各个领域中都得到了广泛应用。 20世纪50年代开始以后，植物组织培养的研究日趋繁荣，10年当中引人注目的进展就有以下7项： 1952年，Morel和Martin首次证实，通过茎尖分生组织的离体培养，可以由已受病毒侵染的大丽花中获得无病毒植株。19531954年，Muir进行单细胞培养获得初步成功。方法是把万寿菊和烟草的愈伤组织转移到液体培养基中，放在摇床上振荡，使组织破碎，形成由单细胞和细胞聚集体组成

29、的细胞悬浮液，然后通过继代培养进行繁殖。Muir等还用机械方法由细胞悬浮液和容易散碎的愈伤组织中分离得到单细胞，把它们置于一张铺在愈伤组织上面的滤纸上培养，使细胞发生了分裂。这种“看护培养”技术揭示了实现Haberlandt培养单细胞这一设想的可能性。1955年，Miller等由鲱鱼精子DNA中分离出一种首次为人所知的细胞分裂素，并把它定名为激动素(kinetin)。现在，具有和激动素类似活性的合成的或天然的化合物已有多种，它们总称为细胞分裂素(cytokinin)。应用这类物质，我们就有可能诱导已经成熟和高度分化的组织(如叶肉和干种子胚乳)的细胞进行分裂。1957年，Skoog和Miller

30、提出了有关植物激素控制器官形成的概念，指出在烟草髓组织培养中，根和茎的分化是生长素对细胞分裂素比率的函数，通过改变培养基中这两类生长调节物质的相对浓度可以控制器官的分化：这一比率高时促进生根，低时促进茎芽的分化，二者浓度相等时，组织则倾向于以一种无结构的方式生长。后来证明，激素可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于在不同组织中这些激素的内生水平不同，因而对于某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源激素的水平也会有所不同。1958年，英国学者FCSteward和JReinert几乎同时在胡萝卜根组织的韧皮部单细胞悬浮培养(single cell suspension cultur

31、e)中发现，体细胞在形态上可转变为与合子胚(zygotic embryo)相似的结构，其发育过程也与合子胚类似。由于它是从体细胞分化而来，因而称为体细胞胚(somatic embryo)或胚状体(embryoid)。在这个实验中，他们分别成功地从胡萝卜根愈伤组织的单细胞悬浮培养液中诱导出胚状体，并长成完整植株(图2)，这一实验证实了Haberlandt的细胞全能性理论，成为了植物组织培养研究历史中的一个里程碑。图2 胡萝卜单细胞发育成植株示意图同年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。这意味着，当把茎尖接种在含有细胞分裂素的培

32、养基上以后，将可使侧芽解除休眠状态，而且，能够从顶端优势下解脱出来的不只是那些既存于原来茎尖上的腋芽，还有由原来的茎尖在培养中长成的侧枝上的腋芽，结果就会形成一个郁郁葱葱的结构，里面包含了数目很多的小枝条，其中每个小枝条又可取出来重复上述过程，于是在相当短的时间内，就可以得到成千上万的小枝条。当把这些小枝条转移到另外一种培养基上诱导生根以后，即可移植于土壤中。后来，Murashige发展了这一方法，制定了一系列标准程序，把这一方法广泛用于由蕨类植物到花卉和果树的快速繁殖上。19581959年，Reinert和Steward分别报道，在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚。这是一种不同于通过芽和根

33、的分化而形成植株的再生方式。现在知道有很多物种都能形成体细胞胚。在有些植物如胡萝卜和毛茛中，事实上由植物体的任何部分都可以得到体细胞胚。综上所述，在这一发展阶段中，通过对培养条件和培养基成分的广泛研究，特别是对B族维生素、生长素和细胞分裂素在组织培养中作用的研究，已经实现了对离体细胞生长和分化的控制，从而初步确立了组织培养的技术体系，并首次用实验证明了细胞全能性的设想，为以后的发展奠定了基础。1.2.3 迅速发展阶段(20世纪60年代至现在) 据罗士韦统计，在20世纪60年代初期，全世界还只有十几个国家的少数实验室从事组织培养研究，但到了20世纪70年代，组织培养领域仍然空白的国家已经屈指可数

34、。20世纪60年代以来组织培养技术所以得到了迅速发展，一方面是由于有了前60年建立的理论和技术基础；另一方面是由于这项技术开始走出了植物学家和植物生理学家的实验室，通过与常规育种、良种繁育和遗传工程技术相结合，在植物改良中发挥了重要的作用，并且在若干方面已经取得了可观的经济效益。20世纪60年代以来组织培养技术的发展，概括起来可以分为4个方面：（1）基础研究再奏凯歌：1965年， Vasil和Hildebrandt用一种化学成分确定的培养基，由分隔培养的烟草单细胞获得了完整的再生植株，进一步证实了植物细胞的全能性。（2）原生质体培养取得重大突破：1960年，英国学者ECCocking用真菌纤维

35、素酶（cellulase）酶解分离番茄根和烟草叶片，获得了原生质体，开创了植物原生质体培养的研究。1971年，日本学者Nagata和I.Takebe首次将烟草叶肉原生质体培养出再生植株。这不但在理论上证明了除体细胞和生殖细胞以外，无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上可以为外源基因的导入提供理想的受体材料。1985年，Fujimura获得了第一例禾谷类作物水稻原生质体培养的再生植株。1986年，Spangenberg获得了甘蓝型油菜单个原生质体培养的再生植株。目前，已在许多种作物中如玉米、小麦、高粱、谷子和大麦等通过原生质体培养获得了再生植株。在这方面，中国学者做出了重要贡献。原生质体培养

36、的成功，促进了体细胞融合技术的发展。1972年，PSCarson利用硝酸钠进行了两个烟草种间原生质体的融合实验，获得了第一株体细胞种间杂种植株。1974年，Kao利用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）进行了大豆和烟草科间原生质体的融合，成功地获得了3的异核体（heterokaryon）。同年，Bonne和Eriksson成功地进行了细胞器（叶绿体）的摄取，利用PEG诱导具有叶绿体的海藻和不具有叶绿体的胡萝卜根原生质体融合获得成功。实验证明：原生质体是引入外源遗传物质的极好材料，为基因工程（gene engineering）提供了良好的受体体系。至此，PEG被公认为是一种

37、比较理想的细胞融合剂，广泛应用于亲缘关系很远，甚至没有亲缘关系的种间细胞融合。如1975年，Cocking成功地诱导鸡红细胞与酵母细胞的融合。1976年，Smith诱导了人的HeLa细胞（指1953年从美国妇女Helen Lane的子宫颈上取出培养的癌细胞系）与烟草细胞的融合。1978年，Melchers进行了马铃薯和番茄的融合实验，获得了第一个属间杂种植株马铃薯番茄（pomato）。1981年，Zimmerman利用改变电场的方法诱导原生质体进行融合，这是原生质体融合技术的新方法。目前，已在多个物种中诱导了不同种间、属间甚至科间及界间的细胞融合，获得了一些具有优良特性或抗性的种间或属间杂种。

38、（3）花药培养取得显著成绩： 19641966年，印度科学家SGuha和SCMaheswari在曼陀罗花药培养(anther culture)中，首次由花粉诱导得到了单倍体(haploid)植株，开创了花粉培育单倍体植物的新途径。1967年，Bourgin和Nitsch通过花药培养获得了完整的烟草植株。由于单倍体在突变选择和加速杂合体纯合化过程中的重要作用，这一领域的研究在整个20世纪70年代得到了迅速发展，获得成功的物种数目增加到160余种，其中包括很多种重要的栽培植物。烟草、水稻和小麦等的花培育种在中国取得了引人注目的成就。（4）微繁技术得到广泛应用：1960年，Morel提出了利用茎尖离

39、体快速无性繁殖兰花属的方法，繁殖系数极高。由于这一方法有巨大的实用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起“兰花工业”。目前，用这种方法繁殖的兰花至少已有35个属150余种。除兰花外，在其他很多观赏植物和经济作物（如甘蔗和草莓等）中，微繁也已达到了工厂化的生产规模，在若干作物中与通过茎尖培养进行脱毒相结合，产生了可观的经济效益。（5）次生代谢物生产前景广阔：1969年，Kaul发现三角叶薯蓣悬浮培养物可以生产薯蓣皂苷配基(diosgenin)，其量为干重的1.5。薯蓣皂苷配基是生产避孕药的一种主要原料。1973年，Furuya和Ishii发现，人参培养细胞可以产生人参皂苷(ginsenosid

40、e)。在小鼠身上的药学实验表明，愈伤组织提取物的作用与人参根提取物的作用基本相同，开创了植物体内有效成分生产的新途径。目前，已从200多种植物的培养组织或细胞中获得了500多种有效代谢化合物，有皂苷类、甾醇类、生物碱、醌类、氨基酸、蛋白质等，取得了巨大的经济效益和社会效益。在整个组织培养发展的历史中，我国学者曾经做出过多方面的贡献。除了前面提到过的崔瀓的关于腺嘌呤或腺苷对组织的生长和芽的形成的影响的工作以外，1933年李继侗、沈同等关于银杏胚胎培养的工作，19351942年间罗宗洛等关于玉米等植物离体根尖培养的工作，以及后来罗士韦关于幼胚和茎尖培养的工作，李正理等关于离体胚培养中形态发生及离体

41、茎尖培养的工作，王伏雄等关于幼胚培养的工作等，都是组织培养各有关领域里的有价值的文献。20世纪70年代以来，我国组织培养研究出现了新的局面，发展速度较快，在某些方面已经做出了举世公认的重要成绩，尤其是在花药培养和原生质体培养方面，我国学者的工作已经受到世界各国同行的普遍重视和赞赏。从上述组织培养发展简史我们可以看到，像任何其他科学领域一样，组织培养在开始时也只是一种纯学术性的研究，用以回答有关植物生长和发育的某些理论问题。但其发展的结果，却显示出巨大的应用价值，某些技术已经在农业生产中直接或间接地产生了显著的经济效益，并且肯定将会产生更大的经济效益。4. 植物组织培养的应用 植物组织培养研究领

42、域的形成，不仅丰富了生物学科的基础理论，还在实际应用中表现出巨大的价值，显示了植物组织培养的无穷魅力。4.1 植物离体快繁（无性系快速繁殖）植物离体快繁是植物组织培养在生产上应用最广泛、产生较大经济效益的一项技术。离体快繁的特点是繁殖系数大、周年生产、繁殖速度快、苗木整齐一致，快速繁殖的植株能保持母本的生物特性和遗传性状，并可在短期内种植于田间等，所以，利用这项技术可以使一个单株一年繁殖几万到几百万个植株。如一株葡萄一年可以繁殖3万多株；一株兰花，一年可繁殖400万株；草莓的一个顶芽，一年可繁殖108个芽。对一些繁殖系数低、不能用种子繁殖的“名、优、特、新、奇”的作物品种的繁殖，更为重要。对于

43、脱毒苗、新育成、新引进、稀缺品种、优良单株、濒危植物和基因工程植株等可通过离体快繁，以比常规方法快数万倍到数百万倍的速度进行扩大增殖，及时提供大量优质种苗或种薯。目前，园艺作物及经济林木等部分或大部分都用离体快繁提供苗木，试管苗在国际市场上已形成产业化。如美国的Wyford国际公司年产组培苗3 000万株，包括花卉、蔬菜、果树及林木；以色列的Benzur苗圃，年产组培苗800万株，主要为观赏植物；中国进人工厂化生产的主要有香蕉、甘蔗、桉树、葡萄、苹果、脱毒马铃薯、脱毒草莓、非洲菊、芦荟等等。4.2 无病毒苗木培育 很多农作物都带有病毒，特别是无性繁殖植物，如马铃薯、甘薯、草莓、大蒜等，病毒在体

44、内积累，影响其生长和产量，对生产造成极大损失。如草莓中分布广、造成严重经济损失的病毒主要有4种，即草莓斑驳病毒、草莓皱缩病毒、草莓镶嵌病毒和草莓轻型黄边病毒；而侵染大蒜和马铃薯的病毒则在10种以上。但是，感病植株并非每个部位都带有病毒，White早在1943年就发现，植物生长点附近的病毒浓度很低甚至无病毒。因此，利用组织培养方法，取一定大小的茎尖进行培养，再生植株就可脱除病毒，获得脱病毒小苗。用脱毒小苗种植的作物就不会或极少发生病毒，并且植株生长势明显增强，整齐一致，产量增加，如脱毒草莓的产量比对照高21.044.9。目前，利用组织培养脱除植物病毒的方法已在许多果树、蔬菜、花卉如苹果、甘蔗、菠

45、萝、香蕉、葡萄、草莓、马铃薯、大蒜、洋葱、兰花、菊花、唐菖蒲等作物上获得成功，并建立了无病毒苗木的培育体系。这种方法同时也去除了真菌、细菌等的危害。4.3 培育新品种或创制新物种 应用植物组织培养的理论和技术，可以加速育种进程，培育新品种或创制自然界中的新物种。 4.3.1 培育远缘杂种 受精后障碍导致远缘杂交的植物不孕，使得植物的种间和远缘杂交常难以成功。采用胚的早期离体培养可以使杂种胚正常发育，产生远缘杂交后代，从而育成新物种。如苹果与梨的杂交种、大白菜与甘蓝的杂交种、栽培棉与野生棉的杂交种等。胚培养已在50多个科、属中获得成功。 通过原生质体的融合，可以克服有性杂交不亲和性，从而获得体细

46、胞杂种，创制出新物种或新类型，这是组织培养应用很诱人的一个方面。目前已获得40余个种间、属间甚至科间的体细胞杂种植株或愈伤组织。如已获得番茄和马铃薯、烟草和龙葵、芥菜等属间杂种，但这些杂种尚无实际应用价值。随着原生质体融合、选择、培养技术的不断成熟和发展，今后可望获得更多有一定应用价值的经济作物的体细胞杂种及新品种。4.3.2 离体选择突变体 培养的细胞无论是愈伤组织还是悬浮细胞，由于处在分裂状态，易受培养条件和诱变因素(如射线、化学物质等)的影响产生变异，从中可以筛选出对人类有用的突变体，从而育成新品种。尤其对原来诱发突变较为困难、突变率较低的一些性状，用细胞培养进行诱发、筛选和鉴定时，由于

47、处理细胞数远远多于处理个体数，因此一些突变率极低的性状有可能从中选择出来，如植物抗病虫性、抗寒、耐盐、抗除草剂毒性、生理生化变异等的诱发，为进一步选育提供了丰富的变异材料。目前，用这种方法已筛选出抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白的突变体，有些已用于生产。4.3.3 单倍体育种 离体花药花粉培养的单倍体育种法，与常规方法相比，基因型可快速纯合，可以在短时间内得到作物的纯系，从而加快育种过程，因而单倍体育种已成为一种新的育种手段。我国科学家设计的N6花药培养基和马铃薯培养基，不仅在国内得到推广，也被国外采用。到1987年为止，据不完全统计，我国各地用花药或花粉培育出的植物已有22科52属160个种，取

48、得了较大的成就。已培育出小麦“花培1号”、“京花1号”，水稻“中花l号”等优良品种，并已大面积推广种植。4.4 次生代谢物生产各种生物体在一定条件下合成多种多样的物质。这些物质中有些是生物体的生长、繁殖不可缺少的具有重要生理意义的基本成分，例如氨基酸、蛋白质、核苷酸、DNA、RNA、糖类、脂质、乙酰辅酶A、莽草酸等，称为初级代谢物。而有些物质在生物体的生长、繁殖中并不是不可缺少的，而是在特定的条件下，在某些生物体的某些组织、器官或细胞中产生的，例如色素、香精、药物、某些酶和多肽等，称为次级代谢物。 植物细胞产生的次级代谢物多种多样，按照用途主要可以分为色素、香精、药物和酶等；按照分子结构主要包

49、括生物碱、类黄酮、香豆素、蒽醌、萜类、甾体、蛋白质和多肽等化合物。利用组织或细胞的大规模培养，可以生产人类需要的一些天然有机化合物，如蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱及其他活性化合物。因此，这一领域引起了人们的极大兴趣。目前，已从200多种植物的培养组织或细胞中获得了500多种有效代谢化合物，包括一些重要药物(如人参、三七、盾叶薯蓣、日本黄连、中国红豆杉、罂粟、烟草等)。有40余种化合物在培养细胞中的含量超过原植物，如粗人参皂苷含量在愈伤组织为21.4，冠瘿组织为19.3，再分化根为27.4，都高于天然人参根的含量(4.1)。特别是天然植物蕴藏量少、含量低但临床效用高的成分，如紫杉醇等，

50、利用组织培养进行大规模生产，具有巨大的经济效益和社会效益。4.5 植物种质资源的离体保存 种质资源(germplasm)是农业生产的基础，而自然灾害、生物间竞争及人类活动等已造成相当数量的植物物种消失或正在消失，特别是具有独特遗传性状的生物物种的绝迹更是一种不可挽回的损失。但常规的植物种质资源保存方法耗费人力、物力和土地，使得种质资源流失的情况时有发生。1975年，Henshaw和Morel首次提出了离体保存(conservation in vitro)植物种质的策略。目前，已有许多种植物在离体条件下，通过抑制生长或超低温贮存的方法，使培养材料能长期保存，并保持其生活力，既节约了人力、物力和土

51、地，还防止了有害病虫的人为传播，更便于种质资源的交换和转移，给保存和抢救有用基因带来了希望。如草莓茎尖在4黑暗条件下，茎培养物可以保持生活力达6年，其间只需每三个月加入一些新鲜培养液；胡萝卜和烟草等植物的细胞悬浮物，在-20-196低温下贮藏数月能恢复生长，并再生成植株。4.6 人工种子 人工种子(artificial seed)的概念是1978年美国生物学家Murashige首先提出的，它是指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽，被包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。人工种子的意义在于：人工种子结构完整，体积小，便于贮藏与运输，可直接播种和机械化操作；不

52、受季节和环境限制，胚状体数量多、繁殖快、利于工厂化生产；利于繁殖生育周期长、自交不亲和、珍贵稀有的一些植物，也可大量繁殖无病毒材料；可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分，提高种子活力和品质；体细胞胚由无性繁殖体系产生，可以固定杂种优势。 虽然人工种子的研究已有二十多年，但一些难题仍然未能很好解决，如人工种皮、防腐、贮藏运输、在体外条件及类似土壤的底物中转化率较低、制作成本高、主要靠手工操作等。这些难题的解决又涉及细胞工程学、植物胚胎学、植物生理学、生物化学、高分子化学、机械加工等技术领域，要求的技术水平较高，所以，目前人工种子的研究仍处于探索阶段。由于人工种子具有许多优点，如繁殖速度快、固定杂种优势、节约粮食等，人工种子的研究方兴未艾。特别是近年来，人工种子技术的研究已逐渐由体细胞胚人工种子转向非体细胞胚（所谓非体细胞胚, 即指芽、短枝、愈伤组织、花粉胚、块茎、球茎等繁殖体, 陈德富等还将芽茎段、原球茎、粒状组织、试管苗等也归入