脉心康对脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化干预作用与机制探讨

1、烦恼有何惧怕，既然躲不掉，就调好心态与它共存。心向阳光，何惧风霜。烦恼有何惧怕，既然躲不掉，就调好心态与它共存。心向阳光，何惧风霜。烦恼有何惧怕，既然躲不掉，就调好心态与它共存。心向阳光，何惧风霜。茫茫人海你我相遇就是缘分，欢迎下载！茫茫人海你我相遇就是缘分，欢迎下载！茫茫人海你我相遇就是缘分，欢迎下载！脉脉心康心康对脂蛋白对脂蛋白E基因敲除小鼠基因敲除小鼠 动脉粥样硬化动脉粥样硬化干预作用与干预作用与机制探讨机制探讨 概述 临床研究 基础研究 意义、创新点及不足 结语 致谢研究背景研究背景研究背景研究背景研究背景研究背景 心脑血管心脑血管病是目前危害人类健康的主病是目前危害人类健康的主要杀手

2、要杀手，而高，而高脂血症、动脉粥样硬化及其所脂血症、动脉粥样硬化及其所致心脑血管疾病则是人类死亡的首位原因。致心脑血管疾病则是人类死亡的首位原因。基因敲除鼠模型的问世给高脂血症、基因敲除鼠模型的问世给高脂血症、AsAs及心及心脑血管疾病的研究带来了飞跃。给我们从后脑血管疾病的研究带来了飞跃。给我们从后天饮食环境等因素与先天遗传因素的双重角天饮食环境等因素与先天遗传因素的双重角度深入研究带来了机遇。度深入研究带来了机遇。 本研究的理论基础及研究方法本研究的理论基础及研究方法 本课题将从器官、组织、细胞、亚细胞、本课题将从器官、组织、细胞、亚细胞、分子、分子、（离子（离子、基因及、基因及膜电位）等

3、膜电位）等不同水平不同水平探讨脉心康探讨脉心康调调脂、抗脂、抗AsAs及稳定及稳定AsAs斑块的多层次、多靶点斑块的多层次、多靶点作用作用及机制及机制。 高脂血症、高脂血症、AsAs的中医病机多属的中医病机多属“脾肾气虚为本脾肾气虚为本，痰瘀毒三邪内蕴为标，痰瘀毒三邪内蕴为标 ；因而确立益气、化痰；因而确立益气、化痰降浊、活血解毒的中医治则。降浊、活血解毒的中医治则。 目目目 的的的 本课题旨在通过临床研究，观察脉心本课题旨在通过临床研究，观察脉心康对高脂血症及颈动脉粥样硬化患者血脂康对高脂血症及颈动脉粥样硬化患者血脂和颈动脉粥样斑块的影响及临床疗效；通和颈动脉粥样斑块的影响及临床疗效；通过基

4、础研究，观察脉心康对食饵性高脂大过基础研究，观察脉心康对食饵性高脂大鼠及载脂蛋白鼠及载脂蛋白E E基因敲除小鼠血脂及动脉粥基因敲除小鼠血脂及动脉粥样硬化的影响并探讨机理。样硬化的影响并探讨机理。高脂血症与动脉粥样硬化的高脂血症与动脉粥样硬化的中医治则中医治则 补益脾肾以固本补益脾肾以固本 痰之化无不在脾，痰之本无不在肾。肾气亏虚、脾痰之化无不在脾，痰之本无不在肾。肾气亏虚、脾失健运是高脂血症与失健运是高脂血症与AsAs的本虚之所在，故治疗中强调补的本虚之所在，故治疗中强调补益脾肾以固本。肾气充足，脾气旺盛，则水谷精微运化益脾肾以固本。肾气充足，脾气旺盛，则水谷精微运化、输布正常，清者自升，浊者

5、自降，自可去痰浊，化瘀、输布正常，清者自升，浊者自降，自可去痰浊，化瘀毒，清脂浊。毒，清脂浊。 祛痰、化瘀、解毒以治标祛痰、化瘀、解毒以治标 肾气亏虚，脾失健运而致痰浊内生。痰浊内阻，又肾气亏虚，脾失健运而致痰浊内生。痰浊内阻，又逐渐形成瘀血，痰浊瘀血互结，日久内生毒邪，痰浊、逐渐形成瘀血，痰浊瘀血互结，日久内生毒邪，痰浊、瘀血、内生毒邪使脉道受损、阻塞，气血不畅而致病。瘀血、内生毒邪使脉道受损、阻塞，气血不畅而致病。因此，以化痰降浊、活血化瘀的同时，还应注意解毒。因此，以化痰降浊、活血化瘀的同时，还应注意解毒。一可降浊脂化瘀血，通畅脉道；二可清除内生毒邪，减一可降浊脂化瘀血，通畅脉道；二可清

6、除内生毒邪，减少脉道损伤。少脉道损伤。脉心康的组方用药脉心康的组方用药 人参人参：补益五脏之气：补益五脏之气 银杏银杏叶：活血化瘀、化痰降浊叶：活血化瘀、化痰降浊 降降脂红曲：健脾消食，活血化瘀脂红曲：健脾消食，活血化瘀 绿茶绿茶 : 解毒解毒化痰并调和诸药化痰并调和诸药 诸药合用，共奏益气健脾补肾、化痰诸药合用，共奏益气健脾补肾、化痰降浊、活血解毒之功。降浊、活血解毒之功。 技术路线图体内实验体外实验血 清学 指标主 动脉冠状动脉及心肌肝脏图象分析系统大体形态病理形态光学显微镜透射、扫描电镜超微结构斑块定量分析原位杂交石蜡切片H E染色病理形态体视学显微镜NF-kBM M P的mRNA表达流

7、式细胞仪肝细胞内钙测定2周龄ApoE（-/-）鼠肝细胞原代培养光学显微镜加药4 8小时后线粒体膜J C- 1测定表达共聚焦显微镜肝细胞形态加药4 8小时后细胞内钙测定6周龄ApoE（-/-）鼠8只6周龄ApoE（-/-）鼠32只随机分为四组正常C57BL/6J小鼠8只实验一实验一 脉心康对脉心康对ApoEApoE （ -/-/-）小鼠小鼠血脂影响的研究血脂影响的研究 体内实验体内实验 对TC的影响对TG的影响对LDL-C的影响结果结果提示：提示： 随着随着时间的延长，在不给药的情况下，时间的延长，在不给药的情况下，ApoE(-/-)ApoE(-/-)小鼠血脂的各指标会在小鼠血脂的各指标会在6

8、6周龄的基周龄的基础上持续上升；而在础上持续上升；而在6 6周龄时给予脉心康、周龄时给予脉心康、洛伐他汀、血脂康干预治疗，血脂各指标上洛伐他汀、血脂康干预治疗，血脂各指标上升缓慢，甚至低于升缓慢，甚至低于6 6周龄的水平。说明脉心周龄的水平。说明脉心康、洛伐他汀、血脂康均能减缓和对抗康、洛伐他汀、血脂康均能减缓和对抗ApoE(-/-)ApoE(-/-)小鼠血脂的升高，且脉心康与洛小鼠血脂的升高，且脉心康与洛伐他汀和血脂康作用相当。伐他汀和血脂康作用相当。实验二实验二 脉心脉心康康抗抗ApoEApoE（ -/-/-）小鼠小鼠 动脉粥样硬化作用动脉粥样硬化作用研究研究 一、脉心康对一、脉心康对一、

9、脉心康对一、脉心康对一、脉心康对一、脉心康对ApoEApoEApoE（-/-/-/-）小鼠动脉粥样小鼠动脉粥样小鼠动脉粥样小鼠动脉粥样小鼠动脉粥样小鼠动脉粥样硬化的影响硬化的影响硬化的影响硬化的影响硬化的影响硬化的影响 图27 各组动脉 正常组 6周龄小鼠模型组 洛伐他汀组 血脂康组 脉心康组 6周龄小鼠 模型组 模型组 正常组洛伐他汀组血脂康组脉心康组正常组 6周龄小鼠 模型组 模型组 洛伐他汀组 血脂康组 脉心康组 正常组 6周龄小鼠 模型组 模型组 洛伐他汀组 血脂康组 脉心康组 正常组 正常组 6周龄小鼠模型组 模型组 模型组 洛伐他汀组 洛伐他汀组 血脂康组 血脂康组 脉心康组 脉心

10、康组 二、脉心康对二、脉心康对ApoE（-/-）小鼠主动脉小鼠主动脉 NF-B mRNA表达的调控作用表达的调控作用 正常组 阴性对照 正常组 模型组 模型组 洛伐他汀组 洛伐他汀组 血脂康组 血脂康组 脉心康组 脉心康组 各给药组与模型组比较，各给药组与模型组比较，NF-NF-BmRNABmRNA阳性细胞表达率阳性细胞表达率均明显降低。均明显降低。 NF-NF-BB mRNA mRNA阳性细胞表达率阳性细胞表达率三、三、脉心康对脉心康对ApoEApoE（-/-/-）小鼠主动脉）小鼠主动脉 MMP-9 mRNAMMP-9 mRNA表达的调控作用表达的调控作用 正常组 阴性对照 正常组 模型组

11、模型组 洛伐他汀组 洛伐他汀组 血脂康组 血脂康组 脉心康组 脉心康组 MMPMMP9 mRNA9 mRNA阳性细胞表达率阳性细胞表达率 各给药组与模型组比较，各给药组与模型组比较， MMP-9 mRNA阳性细胞阳性细胞表达率均明显降低。表达率均明显降低。 实验三实验三 脉心康脉心康对对ApoEApoE（-/-/-）小鼠小鼠 肝肝组织组织的病理形态学的病理形态学影响影响 正常组 模型组 洛伐他汀组 6周龄小鼠血脂康组 脉心康实验四实验四 流式细胞仪检测脉心康对流式细胞仪检测脉心康对ApoEApoE（-/-/-）小鼠肝细胞内钙的影响小鼠肝细胞内钙的影响 阴性对照组 正常组模型组 洛伐他汀组 血脂

12、康组 脉心康组 结果显示，模型组肝细胞内钙离子浓度明显增加结果显示，模型组肝细胞内钙离子浓度明显增加，脉心康组、洛伐他汀组及血脂康组肝细胞内钙，脉心康组、洛伐他汀组及血脂康组肝细胞内钙离子浓度均呈下降趋势，且脉心康优于洛伐他汀离子浓度均呈下降趋势，且脉心康优于洛伐他汀和血脂康。和血脂康。 脉心康对脉心康对ApoEApoE（-/-/-）小鼠肝细胞内小鼠肝细胞内钙钙Fluo-3/AMFluo-3/AM荧光值的影响荧光值的影响 体外实验体外实验 实验一实验一 脉心康对载脂蛋白脉心康对载脂蛋白E E基因基因敲除敲除（ApoE-/-ApoE-/-）小鼠原代培养的肝细胞小鼠原代培养的肝细胞内钙的影响内钙的

13、影响加药前后肝细胞形态学观察加药前后肝细胞形态学观察 加药前 1010 加药前 1025生理盐水组 1010 生理盐水组 1025 洛伐他汀组 1010 洛伐他汀组 1025血脂康组 1010 血脂康组 1025脉心康大剂量 1010 脉心康大剂量组 1025 脉心康小剂量组 1010脉心康小剂量组 1025 肝细胞内钙的肝细胞内钙的Fluo-3/AMFluo-3/AM荧光染色的荧光染色的激光共聚焦显微镜观察激光共聚焦显微镜观察 生理盐水组 洛伐他汀组 血脂康组 脉心康大剂量组 脉心康小剂量组 加药加药4848小时肝细胞内钙的小时肝细胞内钙的Fluo-3/AMFluo-3/AM荧光值荧光值 实

14、验二实验二 脉脉心康对载脂蛋白心康对载脂蛋白E E基因基因敲除敲除（ApoE-/-ApoE-/-）小鼠原代培养小鼠原代培养肝细胞肝细胞线粒体线粒体膜电位膜电位JC-1JC-1的影响的影响 加药加药4848小时肝细胞内线粒体膜电位小时肝细胞内线粒体膜电位Jc-1 Jc-1 荧光染色的荧光染色的激光共聚焦显微镜观察激光共聚焦显微镜观察 生理盐水组 洛伐他汀组 血脂康组 脉心康大剂量组 脉心康小剂量组 加药加药4848小时肝细胞内线粒体膜电位小时肝细胞内线粒体膜电位Jc-1 Jc-1 的红色荧光的红色荧光/ /绿色荧光比值绿色荧光比值 讨 论 血脂升高是主要基础血脂升高是主要基础As与斑块稳定性的相

15、关研究与斑块稳定性的相关研究 平滑肌细胞增殖与平滑肌细胞增殖与As As的超微结构变化的超微结构变化 核因子核因子B与与As 基质金属蛋白酶与基质金属蛋白酶与As 肝与脂代谢及肝与脂代谢及As 一、一、As病因发病机理的有关问题病因发病机理的有关问题二、二、高脂血症与动脉粥样硬化高脂血症与动脉粥样硬化动物模型评价动物模型评价 建立模型的动物条件建立模型的动物条件 建立模型的方法建立模型的方法 动物模型特点动物模型特点三、三、脉心康组方的现代药理脉心康组方的现代药理研究基础研究基础 人参有多种化学成分，其中人参皂甙是最重要的有效人参有多种化学成分，其中人参皂甙是最重要的有效成分。人参皂甙能促进脂

16、质代谢，调节血脂，降低血清胆成分。人参皂甙能促进脂质代谢，调节血脂，降低血清胆固醇，抗动脉粥样硬化。人参皂甙还有显著的抗脂质过氧固醇，抗动脉粥样硬化。人参皂甙还有显著的抗脂质过氧化作用，改善心肌组织缺氧时的能量代谢化作用，改善心肌组织缺氧时的能量代谢 。人参或人参。人参或人参皂甙有抑制血小板聚集的作用。皂甙有抑制血小板聚集的作用。 银杏叶总黄酮能明显降低银杏叶总黄酮能明显降低ApoB和和LDL。银杏叶黄酮甙银杏叶黄酮甙类能够清除氧自由基，调节超氧化物歧化酶、过氧化氢酶类能够清除氧自由基，调节超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等抗氧化酶的活性，减轻等抗氧化酶的活性，减轻LDL的氧化和的氧化和ox-LDL

17、对对VEC的的损伤损伤 。银杏内酯能够抑制血小板聚集。银杏内酯能够抑制血小板聚集。 红曲中含有莫纳可林系列物质，研究发现其对人体胆红曲中含有莫纳可林系列物质，研究发现其对人体胆固醇合成中的关键酶固醇合成中的关键酶HMG-CoA（羟戊二酰辅酶羟戊二酰辅酶A）还还原酶产生抑制作用。红曲中还含有黄酮酚等天然的抗氧原酶产生抑制作用。红曲中还含有黄酮酚等天然的抗氧化剂，具有抑制脂质过氧化、减轻肝脏脂肪变性，降血化剂，具有抑制脂质过氧化、减轻肝脏脂肪变性，降血脂，防治脂，防治As。 绿茶有较强降脂作用，能抑制血清脂质过氧化物的升绿茶有较强降脂作用，能抑制血清脂质过氧化物的升高。茶叶提取物茶多酚能够抑制胆管

18、对胆固醇的吸收，高。茶叶提取物茶多酚能够抑制胆管对胆固醇的吸收，抑制脂蛋白合成，加速脂质分解清除，抑制脂质过氧化抑制脂蛋白合成，加速脂质分解清除，抑制脂质过氧化物。物。 综上所述，四种药物结合应用能够抑制胆固醇和脂综上所述，四种药物结合应用能够抑制胆固醇和脂蛋白的合成，加速脂质分解代谢，从而降低血脂，抗氧蛋白的合成，加速脂质分解代谢，从而降低血脂，抗氧化，保护血管内皮，抑制血小板聚集，抗化，保护血管内皮，抑制血小板聚集，抗As。四、四、阳性对照药的选择阳性对照药的选择 洛伐他汀洛伐他汀(Lovastatin)是第一个上市应用的他汀类降血脂是第一个上市应用的他汀类降血脂药物药物,能选择性抑制体内

19、胆固醇合成限速酶羟甲基戊二酰辅能选择性抑制体内胆固醇合成限速酶羟甲基戊二酰辅酶酶A(HMG-CoA)还原酶，使还原酶，使TC的合成减少，的合成减少，LDL-C合成减合成减少，对动脉硬化和冠心病确切的预防作用，还能降低血清少，对动脉硬化和冠心病确切的预防作用，还能降低血清TG水平，升高水平，升高HDL-C水平。水平。 血脂康是我国自行研发的，以洛伐他汀含量为质量标准血脂康是我国自行研发的，以洛伐他汀含量为质量标准的，目前国内销量最大的降脂中成药制剂，其主要组分为的，目前国内销量最大的降脂中成药制剂，其主要组分为特制降脂红曲，大量的临床和实验研究显示，它能够降低特制降脂红曲，大量的临床和实验研究显

20、示，它能够降低血中血中TC、TG和和LDL水平，具有抗氧化，改善肱动脉内皮依水平，具有抗氧化，改善肱动脉内皮依赖性舒张功能，保护老年陈旧性心梗患者血管内皮的作用赖性舒张功能，保护老年陈旧性心梗患者血管内皮的作用。五、五、脉心康的作用及机理探讨脉心康的作用及机理探讨 调脂作用调脂作用 抗抗AsAs及稳定斑块作用及稳定斑块作用 调节调节ApoE(-/-)小鼠主动脉小鼠主动脉NF-B的的mRNA 表达表达 调节调节ApoE(-/-)小鼠主动脉小鼠主动脉MMP-9的的mRNA表达表达 对肝组织的影响对肝组织的影响 对原代培养肝细胞内钙及线粒体膜电位的对原代培养肝细胞内钙及线粒体膜电位的影响影响脉心康对

21、脉心康对ApoEApoE(-/-)(-/-)小鼠主动脉小鼠主动脉NF-NF-BB的的mRNAmRNA表达影响表达影响 本研究结果显示，本研究结果显示， ApoEApoE(-/-)(-/-)小鼠主动脉小鼠主动脉NF-NF-BB mRNAmRNA表达明显增加，脉心康及对照药洛伐他汀、血表达明显增加，脉心康及对照药洛伐他汀、血脂康均可降低其脂康均可降低其NF-NF-BB mRNA mRNA表达，从而通过调节多表达，从而通过调节多种参与炎症反应、免疫反应、细胞增殖反应的细胞种参与炎症反应、免疫反应、细胞增殖反应的细胞因子，炎症介质、蛋白酶的基因表达及抗因子，炎症介质、蛋白酶的基因表达及抗SMCSMC增

22、殖等增殖等多种调控途径对抗高脂血症及多种调控途径对抗高脂血症及AsAs的形成和发展。的形成和发展。脉心康对脉心康对ApoEApoE(-/-)(-/-)小鼠主动脉小鼠主动脉 MMP-9MMP-9的的mRNAmRNA表达影响表达影响 本研究结果显示，脉心康及对照药洛伐本研究结果显示，脉心康及对照药洛伐 他汀、血脂康均可降低其他汀、血脂康均可降低其MMPMMP9 mRNA9 mRNA表达表达，从而通过多种调控途径对抗，从而通过多种调控途径对抗AsAs的形成和发的形成和发展，尤其对斑块的稳定有十分重要的作用。展，尤其对斑块的稳定有十分重要的作用。 脉心康对脉心康对肝组织的影响肝组织的影响 结果提示，脉

23、心康、洛伐他汀及血脂康均有降结果提示，脉心康、洛伐他汀及血脂康均有降低肝细胞内钙超载，保护肝细胞的作用，且脉心康低肝细胞内钙超载，保护肝细胞的作用，且脉心康更具优势。其作用机制可能为脉心康的益气活血、更具优势。其作用机制可能为脉心康的益气活血、解毒化浊之功，调和了气血，畅通了血脉，使肝内解毒化浊之功，调和了气血，畅通了血脉，使肝内蕴藏的痰浊瘀毒得以疏布排泄体外，从而使其形态蕴藏的痰浊瘀毒得以疏布排泄体外，从而使其形态结构的损害，尤其是膜损害得以修复，膜通道正常结构的损害，尤其是膜损害得以修复，膜通道正常开放，以恢复细胞内外的钙平衡。开放，以恢复细胞内外的钙平衡。脉心康对脉心康对原代培养肝细胞内

24、钙及原代培养肝细胞内钙及线粒体膜电位的影响线粒体膜电位的影响 激光共聚焦显微镜观察显示，对原代培养激光共聚焦显微镜观察显示，对原代培养8 8天的肝细胞分天的肝细胞分别加入生理盐水、洛伐他汀、血脂康及脉心康干预别加入生理盐水、洛伐他汀、血脂康及脉心康干预4848小时后小时后，各给药组肝细胞内钙的荧光强度均明显下降，因此，说明，各给药组肝细胞内钙的荧光强度均明显下降，因此，说明脉心康及洛伐他汀和血脂康均可降低脉心康及洛伐他汀和血脂康均可降低ApoEApoE(-/-)(-/-)小鼠肝细胞内小鼠肝细胞内的钙负荷，从而保护肝细胞。的钙负荷，从而保护肝细胞。 研究发现脉心康及洛伐他汀和血脂康均可升高研究发

25、现脉心康及洛伐他汀和血脂康均可升高ApoEApoE(-/-)(-/-)小鼠肝细胞内线粒体膜电位，促进肝细胞线粒体膜的去极化小鼠肝细胞内线粒体膜电位，促进肝细胞线粒体膜的去极化，从而增强线粒体的功能，促进肝细胞的代谢，以利于降低，从而增强线粒体的功能，促进肝细胞的代谢，以利于降低血脂。且脉心康明显优于血脂康和洛伐他汀。血脂。且脉心康明显优于血脂康和洛伐他汀。 本研究的意义本研究的意义 脉心康以益气活血、化痰解毒降浊为中医治则创制的降脉心康以益气活血、化痰解毒降浊为中医治则创制的降脂和抗脂和抗As的创新复方，在降脂、抗的创新复方，在降脂、抗As和稳定斑块等方面充分和稳定斑块等方面充分体现了中医整体观念和辨证论治的优势。体现了中医整体观念和辨证论治的优势。 以整体动物体内实验与体外细胞培养实验相结合，应用以整体动物体内实验与体外细胞培养实验相结合，应用包括基因敲除动物在内的不同原理的动物模型，从