植物原生质体培养

1、关于植物原生质体培养现在学习的是第一页，共89页第一节第一节 原生质体的用途原生质体的用途 植物原生质体植物原生质体(protoplast)是是没有细胞壁的没有细胞壁的裸露细胞，它裸露细胞，它在一些研究方在一些研究方面具有独特的面具有独特的优势。优势。现在学习的是第二页，共89页1.原生质体是研究细胞骨架、细胞壁的形成、原生质体是研究细胞骨架、细胞壁的形成、细胞膜的结构、大分子物质进出细胞过程细胞膜的结构、大分子物质进出细胞过程与机理等问题的良好实验体系。与机理等问题的良好实验体系。2. 转基因的良好受体：与外源转基因的良好受体：与外源DNA（如质（如质粒）共培养时，原生质体可以直接吸收外粒）

2、共培养时，原生质体可以直接吸收外源源DNA，并整合到染色体上，从而实现，并整合到染色体上，从而实现对植物细胞的遗传转化，进一步通过植株对植物细胞的遗传转化，进一步通过植株再生就可得到再生就可得到转基因植物转基因植物。现在学习的是第三页，共89页GFP质粒浓度对烟草原生质体转基因效率的影响质粒浓度对烟草原生质体转基因效率的影响GFP=绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白现在学习的是第四页，共89页PEG介导的甜橙原生质体转介导的甜橙原生质体转GFP PCR分析Sothern杂交分析现在学习的是第五页，共89页3. 体细胞杂交（体细胞杂交（somatic hybridization）：）：由于原生质体没有细胞

3、壁，所以不同的原由于原生质体没有细胞壁，所以不同的原生质体可以相互靠近，发生融合。生质体可以相互靠近，发生融合。2种不种不同植物体细胞发生融合的过程，称为体细同植物体细胞发生融合的过程，称为体细胞杂交。胞杂交。所得到的融合细胞为杂种细胞，所得到的融合细胞为杂种细胞，再通过植株再生就可能创造出新的植物个再通过植株再生就可能创造出新的植物个体。体。现在学习的是第六页，共89页Tomato-potato hybrid现在学习的是第七页，共89页第二节第二节 原生质体的分离原生质体的分离 要进行原生质体培养和操作，就必需要进行原生质体培养和操作，就必需有大量高质量的原生质体。分离原生质有大量高质量的原

4、生质体。分离原生质体主要采用酶解法。体主要采用酶解法。酶解法酶解法：利用酶降解植物细胞壁而获得原：利用酶降解植物细胞壁而获得原生质体。生质体。酶解法分离原生质体的效率高，酶解法分离原生质体的效率高，用少量的材料就可以得到大量完整的原用少量的材料就可以得到大量完整的原生质体，已成为分离原生质体的最主要生质体，已成为分离原生质体的最主要方法。方法。现在学习的是第八页，共89页现在学习的是第九页，共89页一、一、 材料的选择材料的选择 用于分离原生质体的植物材料应是用于分离原生质体的植物材料应是细胞分细胞分裂旺盛的材料裂旺盛的材料，如幼嫩小苗的根、胚轴、子，如幼嫩小苗的根、胚轴、子叶、幼叶等；处于快

5、速生长期的愈伤组织或叶、幼叶等；处于快速生长期的愈伤组织或悬浮细胞。对于容易培养、再生能力强的叶悬浮细胞。对于容易培养、再生能力强的叶植物（如烟草、菊花、胡萝卜、矮牵牛等）植物（如烟草、菊花、胡萝卜、矮牵牛等）也可用完全展开的叶片作材料。也可用完全展开的叶片作材料。现在学习的是第十页，共89页二、二、 酶解处理酶解处理 1. 酶解液准备：酶解液准备：由于植物细胞壁的主要成由于植物细胞壁的主要成分是纤维素、半纤维素和果胶质组成的，分是纤维素、半纤维素和果胶质组成的，所以酶解液中一般应含有纤维素酶、半纤所以酶解液中一般应含有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶，浓度为维素酶和果胶酶，浓度为0.5-2.0%

6、。在配酶。在配酶解液时可以用原生质体培养基作溶解剂，解液时可以用原生质体培养基作溶解剂，也可用专门的溶液（也可用专门的溶液（CPW溶液）作溶解剂。溶液）作溶解剂。现在学习的是第十一页，共89页CPW=Cell-Protoplast Wash Medium KH2PO4 27.2 mg/LKNO3 101.0 mg/LCaCl22H2O 148.0 mg/LMgSO47H2O 246.0 mg/LKI 0.16 mg/LCu SO45H2O 0.025 mg/L现在学习的是第十二页，共89页 为了保持释放出来的原生质体的活力和膜为了保持释放出来的原生质体的活力和膜稳定性，必须使原生质体处于一个等

7、渗环境稳定性，必须使原生质体处于一个等渗环境中。中。因此，酶解液中因此，酶解液中 必须加入渗透压调节必须加入渗透压调节剂。剂。 常用的渗透压调节剂有常用的渗透压调节剂有葡萄糖、甘露醇和葡萄糖、甘露醇和山梨醇山梨醇等，浓度一般为等，浓度一般为0.35-0.8mol/L。具体。具体用什么浓度，可根据材料的水势来确定。用什么浓度，可根据材料的水势来确定。酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进行酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进行灭菌，并且随配随用。灭菌，并且随配随用。现在学习的是第十三页，共89页2. 酶解：将植物材料放入酶解液中、释放酶解：将植物材料放入酶解液中、释放出原生质体的过程。出原生质体的

8、过程。 叶片、幼茎和根等材料要切成小片；叶片、幼茎和根等材料要切成小片； 叶片最好撕去下表皮。悬浮细胞要离心叶片最好撕去下表皮。悬浮细胞要离心后再酶解。后再酶解。 材料与酶解液的比例：材料与酶解液的比例：2-10g/100ml酶酶解液。解液。 一般在一般在252、黑暗中酶解，期间轻、黑暗中酶解，期间轻轻摇动几次，或放在轻摇动几次，或放在50rpm的摇床上。的摇床上。酶解时间因材料而异，酶解时间因材料而异，2小时小时十几小时。十几小时。 现在学习的是第十四页，共89页苜蓿叶片的酶解法分离苜蓿叶片的酶解法分离原生质体原生质体现在学习的是第十五页，共89页三、原生质体的收集与纯化三、原生质体的收集与

9、纯化过滤：过滤：酶解结束后，将酶解物通过孔径为酶解结束后，将酶解物通过孔径为20-80m的不锈钢筛网的不锈钢筛网过滤，过滤，除去未被酶解的组织块除去未被酶解的组织块和细胞团。和细胞团。离心：离心：滤液转到离心管中在滤液转到离心管中在50g下下离心离心5min。反复洗涤：反复洗涤：离心结束后，弃去上清液，用培养离心结束后，弃去上清液，用培养基和原生质体洗液重新基和原生质体洗液重新悬浮悬浮沉淀的原生质体，再沉淀的原生质体，再离心。如此离心。如此反复反复2-4次，就可以将残留的酶液去次，就可以将残留的酶液去掉掉。纯化：纯化：用含高浓度（用含高浓度（21%）蔗糖的培养基进行离）蔗糖的培养基进行离心、纯

10、化，完整的原生质体漂浮在上清液的上部。心、纯化，完整的原生质体漂浮在上清液的上部。现在学习的是第十六页，共89页苜蓿叶片原生苜蓿叶片原生质体的纯化质体的纯化完整的原生质体完整的原生质体现在学习的是第十七页，共89页5. 收集原生质体：收集原生质体：现在学习的是第十八页，共89页完整的原生质体完整的原生质体现在学习的是第十九页，共89页四、原生质体活力的测定四、原生质体活力的测定 原生质体活力的高低对后来的原生质原生质体活力的高低对后来的原生质体培养和融合影响极大。原生质体分离体培养和融合影响极大。原生质体分离过程中的任何一个步骤都会影响到原生过程中的任何一个步骤都会影响到原生质体的活力，因此，

11、必须十分小心。测质体的活力，因此，必须十分小心。测定原生质体活力的方法常用定原生质体活力的方法常用荧光素双醋荧光素双醋酸酯（酸酯（FDA）染色法。）染色法。 原生质体活力（原生质体活力（%）=发荧光的原生质发荧光的原生质体数体数/原生质体总数原生质体总数100现在学习的是第二十页，共89页FDAFDA荧光素荧光素酶水解酶水解紫外光紫外光荧光素荧光素完整、有活力的完整、有活力的原生质体原生质体细胞核细胞核荧光素双醋酸酯荧光素双醋酸酯现在学习的是第二十一页，共89页第三节第三节 原生质体培养原生质体培养原生质体制原生质体制备好后，用备好后，用培养基将原培养基将原生质体调至生质体调至一定的密度一定的

12、密度（最低起始（最低起始细胞密度以细胞密度以上），及时上），及时地进行培养地进行培养。现在学习的是第二十二页，共89页 在适宜的培养条件下，原生质体数小在适宜的培养条件下，原生质体数小时后开始形成新的时后开始形成新的细胞壁细胞壁，在显微镜下，在显微镜下可见原生质体由圆球形逐渐变为方形、可见原生质体由圆球形逐渐变为方形、多边形等。约多边形等。约24-36h后，原生质体开始后，原生质体开始发生发生第一次分裂第一次分裂；以后随着细胞分裂，；以后随着细胞分裂，原生质体就形成原生质体就形成细胞团细胞团， 进一步诱导进一步诱导出出植株。植株。现在学习的是第二十三页，共89页苜蓿原生质苜蓿原生质体分裂体分裂

13、现在学习的是第二十四页，共89页6 weeks8 weeks苜蓿原生质体形成细苜蓿原生质体形成细胞团胞团现在学习的是第二十五页，共89页苜蓿原生质体苜蓿原生质体再生植株再生植株现在学习的是第二十六页，共89页转转GFP基因的苜蓿原生质体再生植株基因的苜蓿原生质体再生植株现在学习的是第二十七页，共89页夜来香原生质体植株再生夜来香原生质体植株再生1天天5天天7天天10天天现在学习的是第二十八页，共89页4周周5周周7周周现在学习的是第二十九页，共89页单倍体烟草原生质体培单倍体烟草原生质体培养与植株再生养与植株再生现在学习的是第三十页，共89页杨树原生质体培养植株再生7000,000cells/

14、g fresh leaves25000cells/ml;NH4NO3-free MS+5 M 2,4-D+ 0.05 TDZ M .PE: 34.7% at day 14现在学习的是第三十一页，共89页杨树原生质体培养植株再生Liquid MS+5 M 2,4-D;MS+10 M KT or 1 M TDZ.现在学习的是第三十二页，共89页杨树原生质体培养植株再生1/2MS现在学习的是第三十三页，共89页 将含原生质体的培养液倒入培养皿底部，使将含原生质体的培养液倒入培养皿底部，使其成一薄层，封口后进行培养。其成一薄层，封口后进行培养。1. 液体浅层培养液体浅层培养原生质体的培养方法原生质体的

15、培养方法含原生质体的液体培养基现在学习的是第三十四页，共89页特点：特点：操作简单，对原生质体的损伤小；操作简单，对原生质体的损伤小；容易添加新鲜培养基和转移培养物；容易添加新鲜培养基和转移培养物；原生质体分布不均匀，易发生原生质体之间原生质体分布不均匀，易发生原生质体之间粘连；粘连；原生质体的位置不能固定，所以不能跟踪观原生质体的位置不能固定，所以不能跟踪观察单个原生质体的生长过程。察单个原生质体的生长过程。现在学习的是第三十五页，共89页2. 固体培养固体培养 （平板培养）（平板培养） 35左右的琼脂或琼脂糖培养基与原生质体左右的琼脂或琼脂糖培养基与原生质体溶液混合，摇匀，倒入培养皿中，琼

16、脂或琼脂溶液混合，摇匀，倒入培养皿中，琼脂或琼脂糖凝固后，就成一薄层。糖凝固后，就成一薄层。 进行平板培养时，进行平板培养时，要注意混合时培养基的温度要注意混合时培养基的温度。温度高对原生质体的伤害大；温度低，培养基凝固。温度高对原生质体的伤害大；温度低，培养基凝固，原生质体与培养基不能混匀。，原生质体与培养基不能混匀。特点：特点：原生质体被固定，易观察、统计原生质体原生质体被固定，易观察、统计原生质体的分裂情况；添加新鲜培养基和转移培养物比较的分裂情况；添加新鲜培养基和转移培养物比较麻烦。麻烦。含原生质体的固体培养基现在学习的是第三十六页，共89页（1）液体浅层）液体浅层固体平板培养双层培养

17、法：固体平板培养双层培养法：培养皿底部铺一层琼脂或琼脂糖培养基，再培养皿底部铺一层琼脂或琼脂糖培养基，再将原生质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表将原生质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。面。优点优点是固体培养基中的营养可以缓慢释是固体培养基中的营养可以缓慢释放倒液体培养基中。如果在固体培养基中加放倒液体培养基中。如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸附培养物分泌的有毒物入活性炭，还可以吸附培养物分泌的有毒物质，促进原生质体的生长和分裂。质，促进原生质体的生长和分裂。3. 液体液体固体结合培养固体结合培养固体培养基含原生质体的液体培养基现在学习的是第三十七页，共89页 （2）琼脂糖珠培养：）琼脂糖

18、珠培养：用移液管吸取含原生质体的琼用移液管吸取含原生质体的琼脂糖培养基，滴在培养皿或三角瓶中，待其凝固后，脂糖培养基，滴在培养皿或三角瓶中，待其凝固后，再加入适量的液体培养基，进行旋转培养。再加入适量的液体培养基，进行旋转培养。也可以也可以等含原生质体的琼脂糖培养基凝固后，用刀将其切成等含原生质体的琼脂糖培养基凝固后，用刀将其切成小块，再放入液体培养基中培养。小块，再放入液体培养基中培养。 改进改进了培养物的通气和营养环境，从而促进可以了培养物的通气和营养环境，从而促进可以促进原生质体的分裂及细胞团的形成。促进原生质体的分裂及细胞团的形成。含原生质体的琼脂糖珠含原生质体的琼脂糖珠液体培养基现在

19、学习的是第三十八页，共89页 在培养过程中，在培养过程中， 原生质体分裂开始原生质体分裂开始以后，培养基中的甘露醇或山梨醇的浓以后，培养基中的甘露醇或山梨醇的浓度要逐渐度要逐渐降低降低，否则会影响细胞的继续，否则会影响细胞的继续生长、分裂。待原生质体形成的细胞团生长、分裂。待原生质体形成的细胞团（愈伤组织）达到（愈伤组织）达到1mm时，应将时，应将细胞细胞团转移团转移到新鲜的培养基上继续培养。到新鲜的培养基上继续培养。所形成的愈伤组织就可以按照普通的所形成的愈伤组织就可以按照普通的愈伤组织进行培养和愈伤组织进行培养和植株再生植株再生。 现在学习的是第三十九页，共89页现在学习的是第四十页，共8

20、9页三、影响原生质体培养效果的因素三、影响原生质体培养效果的因素 原生质体培养效果的好坏，也可以用植板率来衡量。原生质体培养效果的好坏，也可以用植板率来衡量。1. 植物材料：植物材料：用于分离原生质体的植物材料对原生用于分离原生质体的植物材料对原生质体后来培养的效果影响极大。质体后来培养的效果影响极大。不同的植物、同不同的植物、同一植物不同的品种一植物不同的品种，其遗传组成存在差异，原生，其遗传组成存在差异，原生质体的培养效果也就必然有差异。如质体的培养效果也就必然有差异。如Yamada曾曾用用26个水稻品种的种子诱导出愈伤组织，再建立悬浮个水稻品种的种子诱导出愈伤组织，再建立悬浮细胞培养，以

21、悬浮细胞分离原生质体，结果只有细胞培养，以悬浮细胞分离原生质体，结果只有1个个品种的原生质体再生了植株。一般来说，品种的原生质体再生了植株。一般来说，容易培容易培养的植物、外植体，其原生质体也容易培养养的植物、外植体，其原生质体也容易培养，反之，反之，亦然。草本比木本容易，亦然。草本比木本容易，幼嫩的材料幼嫩的材料比成熟的材料比成熟的材料容易。容易。 现在学习的是第四十一页，共89页2. 培养基培养基（1） 基本培养基：基本培养基：不同植物原生质体要求不同植物原生质体要求有不同的基本培养基。使用什么基本培养有不同的基本培养基。使用什么基本培养基，可以参照相应培养愈伤组织或细胞的基，可以参照相应

22、培养愈伤组织或细胞的培养基。一般认为，原生质体培养基种的培养基。一般认为，原生质体培养基种的大量元素应比愈伤组织培养基中的大量元大量元素应比愈伤组织培养基中的大量元素浓度低。由于素浓度低。由于Ca2+影响到膜的稳定性，影响到膜的稳定性，因此较高因此较高Ca2+浓度的对原生质体分裂有利。浓度的对原生质体分裂有利。现在学习的是第四十二页，共89页（2） 有机成分：有机成分：同培养细胞、愈伤组织相比，培同培养细胞、愈伤组织相比，培养原生质体时要求培养基有更丰富的有机成分，养原生质体时要求培养基有更丰富的有机成分，如氨基酸、维生素、如氨基酸、维生素、CW，YE，LH，CH、小牛、小牛血清等。大量的结果

23、表明，培养基中添加谷氨酰血清等。大量的结果表明，培养基中添加谷氨酰胺有利于原生质体的分裂。胺有利于原生质体的分裂。（3） 激素：激素：培养基中要加入一定浓度的细胞分裂素和培养基中要加入一定浓度的细胞分裂素和生长素。由于生长素。由于2,4-D 促进细胞分裂能力很强，所以培促进细胞分裂能力很强，所以培养基中大都要加养基中大都要加2,4-D。 （4） 条件化培养基：条件化培养基：使用条件化培养基可以大大使用条件化培养基可以大大促进原生质体的分裂和细胞团的形成。促进原生质体的分裂和细胞团的形成。 现在学习的是第四十三页，共89页（5）培养基中的渗透压：）培养基中的渗透压：原生质体无细胞原生质体无细胞壁

24、，所以培养基中必须使用渗透压调节壁，所以培养基中必须使用渗透压调节剂（甘露醇、山梨醇等），以维持原生剂（甘露醇、山梨醇等），以维持原生质体的稳定。但渗透压调节剂浓度较高质体的稳定。但渗透压调节剂浓度较高往往会抑制细胞分裂和后来的细胞生长。往往会抑制细胞分裂和后来的细胞生长。因此，培养基中渗透压调节剂的浓度不因此，培养基中渗透压调节剂的浓度不能太高，并且在后来的培养过程中要逐能太高，并且在后来的培养过程中要逐渐降低甘露醇或山梨醇的浓度，以利于渐降低甘露醇或山梨醇的浓度，以利于细胞的持续分裂和生长。细胞的持续分裂和生长。 现在学习的是第四十四页，共89页第三节第三节 体细胞杂交体细胞杂交(soma

25、tic hybridization)由于没有细胞壁的限制，原生质体可以彼此靠由于没有细胞壁的限制，原生质体可以彼此靠近，通过膜的融合而融为一体。如果两个相同近，通过膜的融合而融为一体。如果两个相同的原生质体发生融合，则可以实现染色体加倍的原生质体发生融合，则可以实现染色体加倍。Protoplast fusion现在学习的是第四十五页，共89页期盼的马铃薯与番茄杂种植株期盼的马铃薯与番茄杂种植株 如果两个不同植物的原生质体融合，则就可如果两个不同植物的原生质体融合，则就可以形成一个新的杂种细胞，此杂种细胞通过植以形成一个新的杂种细胞，此杂种细胞通过植株再生，则可以得到杂种植株。株再生，则可以得到

26、杂种植株。两个不同植物两个不同植物体细胞发生融合的过程，称为体细胞杂交。体细胞发生融合的过程，称为体细胞杂交。现在学习的是第四十六页，共89页 体细胞杂交克服了有性杂交时生殖隔体细胞杂交克服了有性杂交时生殖隔离的限制，为创造种间杂种、属间杂种，离的限制，为创造种间杂种、属间杂种，甚至科间杂种创造了条件。甚至科间杂种创造了条件。体细胞杂交包括体细胞杂交包括4个过程：个过程： 原生质体的分离；原生质体的分离； 原生质体的融合；原生质体的融合； 杂种细胞的选择和植株再生；杂种细胞的选择和植株再生； 杂种植株的鉴定。杂种植株的鉴定。 现在学习的是第四十七页，共89页一、原生质体的分离一、原生质体的分离

27、二、原生质体的融合二、原生质体的融合 原生质体融合的过程完全是一个机械过原生质体融合的过程完全是一个机械过程，所有植物的原生质体都可以发生融程，所有植物的原生质体都可以发生融合。合。 有些植物的原生质体可以自发融合，有些植物的原生质体可以自发融合，但大多数植物的原生质体需要在诱导剂但大多数植物的原生质体需要在诱导剂的诱导下才能发生。诱导原生质体的方的诱导下才能发生。诱导原生质体的方法有化学法和物理法法有化学法和物理法2种。种。现在学习的是第四十八页，共89页（一）化学诱导法（一）化学诱导法化学诱导法是利用一些化学物质，如化学诱导法是利用一些化学物质，如NaNO3、聚乙二醇（、聚乙二醇（poly

28、ethylene glycol, PEG）、高钙高、高钙高pH等。等。原理：原理：消除原生质体表面的电荷，促进原消除原生质体表面的电荷，促进原生质体彼此靠近、接触，并能促进接触生质体彼此靠近、接触，并能促进接触处的细胞膜发生融解，从而实现原生质处的细胞膜发生融解，从而实现原生质体融合的。体融合的。最常用的是聚乙二醇法和高钙高最常用的是聚乙二醇法和高钙高pH法。法。 现在学习的是第四十九页，共89页(1) 聚乙二醇法（聚乙二醇法（PEG） 聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）是高分子的有机化）是高分子的有机化合物。用于诱导原生质体融合合物。用于诱导原生质体融合PEG的分子的分子量为量为6000。PEG诱

29、导融合剂一般用诱导融合剂一般用0.01molL- 1 CaCl22H2O溶液配制，溶液配制，PEG浓度为浓度为30%-50%，蔗糖浓度为，蔗糖浓度为4%，可以用高温高压，可以用高温高压法灭菌，可以在法灭菌，可以在4下保存。下保存。现在学习的是第五十页，共89页() 高钙高高钙高pH法法 高钙高高钙高pH法的诱导剂为：法的诱导剂为： 0.05 M 甘氨酸甘氨酸-NaOH缓冲液缓冲液 1.1% CaCl26H2O 9 % 甘露醇甘露醇 pH 10.4（过滤消毒，随用随配）（过滤消毒，随用随配） 现在学习的是第五十一页，共89页主要步骤：主要步骤：（1）在离心管中分别将）在离心管中分别将2种植物的原

30、生质体密度调至种植物的原生质体密度调至5-8105 个个/ml，然后等体积混合。，然后等体积混合。（2）向原生质体混合液中加入等体积的诱导融合剂，轻轻）向原生质体混合液中加入等体积的诱导融合剂，轻轻摇匀后，放置摇匀后，放置10 min。高钙高。高钙高pH法诱导融合时要保温法诱导融合时要保温（30-37）。）。（3）离心（）离心（100g，10min），弃去上清液，用培养），弃去上清液，用培养基悬浮原生质体。基悬浮原生质体。（）重复（）次，最后用培养基调至适当的密（）重复（）次，最后用培养基调至适当的密度。度。（）培养（液体浅层培养、平板培养等）（）培养（液体浅层培养、平板培养等）现在学习的是第

31、五十二页，共89页对称体细胞杂交对称体细胞杂交: 2个原生质体的细胞质和细胞核完全融合形成一个杂种细胞。不对称杂交：不对称杂交：一个原生质体的细胞质完全丢失，另外一个原生质体的细胞核完全丢失，再融合形成一个杂种细胞。 用X射线、射线、碘乙酸、碘乙酰胺处理一个原生质体，使其核失活；用罗丹明（R-6-G，一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程）使另外一个原生质体的细胞质失活。现在学习的是第五十三页，共89页原生质体原生质体A原生质体原生质体B混合混合诱导剂诱导剂混合，混合，10min反复洗涤反复洗涤调节密度，培养，植株再生调节密度，培养，植株再生杂种植株选择与鉴定杂种植株选择与鉴定射线、化射

32、线、化学物质学物质处理射线、化射线、化学物质学物质处理现在学习的是第五十四页，共89页 化学诱导原生质体融合方法试剂化学诱导原生质体融合方法试剂便宜，成本低。但操作烦琐，而且便宜，成本低。但操作烦琐，而且化学物质的处理往往会影响原生质化学物质的处理往往会影响原生质体的活力，特别是不纯净的体的活力，特别是不纯净的PEG。对原生质体活力的影响与化学物对原生质体活力的影响与化学物质浓度、时间有关。质浓度、时间有关。现在学习的是第五十五页，共89页（二）物理方法（电融合，（二）物理方法（电融合，electrofusion） 电融合诱导原生质体融合是在电融合电融合诱导原生质体融合是在电融合仪上进行的。通

33、过高频（仪上进行的。通过高频（500K Hz-2MHz）电场脉冲处理原生质体，可以使接触处电场脉冲处理原生质体，可以使接触处的原生质体发生膜穿孔，最终导致原生的原生质体发生膜穿孔，最终导致原生质体融合。这种方法操作比较简单，无质体融合。这种方法操作比较简单，无复杂的原生质体洗涤过程，对原生质体复杂的原生质体洗涤过程，对原生质体的副作用比较小。但电融合仪非常昂贵。的副作用比较小。但电融合仪非常昂贵。 现在学习的是第五十六页，共89页电融合仪下的薄荷原生质体现在学习的是第五十七页，共89页Example of protoplast fusion - left: application of AC

34、field, right: application of DC pulse 现在学习的是第五十八页，共89页 原生质体融合是随机过程。在大群原生质体融合是随机过程。在大群体诱导融合时，体诱导融合时，A、B两种原生质体可以两种原生质体可以发生多种融合，如发生多种融合，如A-A，B-B，A-B。其。其中只有中只有A-B是所希望的。挑选杂种细胞是是所希望的。挑选杂种细胞是比较困难的，主要方法有：比较困难的，主要方法有： 三、杂种细胞的鉴定三、杂种细胞的鉴定现在学习的是第五十九页，共89页1. 表观差异：根据表观差异：根据2种植物显著的表观差异，种植物显著的表观差异，找出中间类型的细胞团。如正常绿色叶

35、和白找出中间类型的细胞团。如正常绿色叶和白化叶的原生质体融合后，其细胞的绿色程度化叶的原生质体融合后，其细胞的绿色程度就会介于就会介于2者之间。者之间。2. 选择标记：选择标记：抗性（抗生素、除草剂）抗性（抗生素、除草剂）标记标记、营养互补标记、颜色等。、营养互补标记、颜色等。现在学习的是第六十页，共89页PEG法诱导红白菜与榨菜原生质体法诱导红白菜与榨菜原生质体融合与植株再生融合与植株再生现在学习的是第六十一页，共89页融合过程融合过程现在学习的是第六十二页，共89页杂种体细胞杂种体细胞,中间颜色中间颜色(黄绿色与红色黄绿色与红色)现在学习的是第六十三页，共89页杂种体细胞分裂、形成愈伤组织

36、杂种体细胞分裂、形成愈伤组织 分化芽分化芽现在学习的是第六十四页，共89页四、再生植株的鉴定四、再生植株的鉴定原生质体融合后的杂种细胞以后生长情况：1、2个细胞的细胞质和细胞核，保持完整、不丢失,同步分裂。对称体细胞杂交对称体细胞杂交（完全融合）（完全融合）2、一个细胞的细胞质和核完全丢失，变为普通细胞3、一个细胞质完全丢失，另外一个细胞核完全丢失，质-核杂种细胞。不对称杂交不对称杂交4、一个或者两个细胞的细胞质和染色体不同程度丢失，质-核杂种细胞（常常其中1个细胞的绝大部分染色体丢失，部分基因整合到另外一个细胞的基因组中）。不不对称杂交对称杂交。现在学习的是第六十五页，共89页体细胞杂种再生植株的鉴定：体细胞杂种再生植株的鉴定：1. 形态观测：形态观测：2. 细胞学分析：细胞学分析：3. 分子鉴定：分子鉴定：4. 同功酶鉴定同功酶鉴定现在学习的是第六十六页，共89页再生植株的形态比较再生植株的形态比较 红白菜红白菜 杂种植株杂种植株 榨菜榨菜现在学习的是第六十七页，共89页拟南芥与油菜原生质体融合再生植株叶片形态拟南芥与油菜原生质体融合再生植株叶片形态拟南芥拟南芥油菜油菜杂种杂种现在学习的是第六十八页，共89页薄荷原生质体融合再生植株叶片比较现在学习的是第六十九页，共89页拟南芥拟南芥萝卜萝卜杂种杂种拟南芥和萝卜原生质体