血细胞超微结构研究方法13茹永新

1、Methodology of Experimentalhematology Course 19Ru Yongxin/ 茹永新Ultrastructural Research of Blood Cells Electron Microscope Dep.Content and Points1 Principle and methods of TEM¾¾¾1.1structure and principle1.2 related methods1.3 TEM methoids for blood cell2 Blood cell ultrastructure¾

2、;¾¾2.1 General cell ultrastructure2.2 Observation steps2.3 Development of blood cell3 Application of TEM in diagnosis1.1 Structure and Principle显微镜镜筒顶部电子枪钨丝阴极第一聚光镜发射电子第二聚光镜物镜样品散射电子束聚焦、平行部分散射部分透射成像于中间镜和投影镜逐级放大荧光屏照相干版。电子显微镜的组成系统Ø 电子光学系统Ø 高压系统Ø 数据采集系统（新型）Ø 电子控制系统（新旧差别）

3、6; 真空系统透射电镜成像原理在真空条件下，电子束经高压加速后，穿透样品时形成散射电子和透射电子，它们在电磁透镜的作用下在荧光屏上成像。Patterns and FacilitiesTEM: Japan:JEOL, HITACHIGermany : Fillips LaboratoryMicrotomeJEM-2100F透射电子显微镜透射电镜观察生物样品的原理电镜图像由生物标本中原子散射电子量不同形成反差，序数越高散射电子越多，荧光屏或胶片上亮度越低。生物样品主要由碳、氢、氧、氮低序数原子构成，样品不同部位与重金属结合力不同，散射电子量不同，使电子在荧光屏上或感光片上形成反差。常用重金属铀和铅

4、加强图像反差。铀与核酸、核蛋白、糖元、分泌颗粒、溶酶体亲和力强，与膜结构弱。铅与细胞各成份均有广泛的亲和作用，尤其有还原锇存在时，会大大增加图像反差。光镜和透射电镜比较显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMTEM500nm100nm0.2nm可见光（400- 700）紫外光（约200nm)电子束（0.01-0.9）玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差Point 1:光镜，电镜和透射电镜结构比较光镜和透射电镜比较光镜（LM）透射电镜(TEM)扫描电镜(SEM)照明

5、可见电子束电子束透镜玻璃透镜电磁透镜电磁透镜分辨率0.5um0.2nm1-10nm计量单位umnmnm放大倍率40-1000倍80-100万倍20-40万倍景深浅中等深成像原理光线吸收为主电子散射作用二次电子信息成像方式直接成像荧光屏成像显像管间接成像图像颜色彩色黑白黑白样品环境空气高真空高真空样品制作较简便复杂较复杂Measurement Unit计量单位：1 mm=100m; 1m=1000 nm;1 nm =10A放大倍率：人眼分辨力/光镜/电镜分辨力200m/0.5m/0.2nm=100万倍ExamplesExamples1. 2 电镜组织样品处理方法-11）取材：“准、快、轻、小”原

6、则。“准”，准确定位和定向； “快”，标本离体0.5-2 分钟内浸入固定液，最大限度保存细胞在体内状态原貌；“轻”，避免挤压或钳拉组织，减少人为影响；“小2）前固定构。固定液穿透力较弱，标本以1为宜。类固定液固定4 小时以上，完全保存精细结3） 后固定：锇酸固定标本2 小时。4） 脱水：丙酮或乙醇系列脱水，每级5-15 分钟。5） 浸透：环氧丙烷浸透15-30 分钟，包埋剂浸透过夜。6） 包埋：置换纯包埋剂，60条件下24-36 小时聚合。7） 切片：超薄切片机切成50nm 切片（500A）。8） 电子染色：醋酸铀染色30-45 分钟，柠檬酸铅复染30 分钟。processesØ 取

7、材Ø 标本：戊二醛（2%，6%），F4G0.1(免疫)Ø 后固定：1%锇酸，加强电子染色Ø 包埋方法：812树脂Ø 超薄切片：50nm80nmØ 电子染色：醋酸铀饱和溶液，硝酸铅溶液Diagram of routine proceduresOur EM LaboratoryEmbeddingLKB-microtomeClean and quiet roomObservationRoomDark room, film and photos1.2 related methods冷冻蚀刻技术：迅速冷冻细胞，断裂细胞，研究膜结构。冷冻超薄切片：以快速冷

8、冻代替固定、脱水以及包埋步 骤，用于细胞化学、免疫电镜研究。放射自显影技术：在标本上涂感光乳胶，使溴化银标本的核素在射线作用下感光。用以研究核酸代谢，脂类蛋白质合成、分泌及亚细胞结构与功能的关系。电镜细胞化学技术：细胞内特定化学产物形成高电子密度沉淀物，电镜原位研究细胞内酶类分布。电镜免疫标记：电镜下观察抗原抗体结合物，定性、鉴别和定位。X射线显微分析技术：在电镜内以高速细电子束轰击样品表面的微小区域，使该区域所含元素发出特异性 射线，再以线检测装置，分析线波长和能量，了解该区域内元素的种类和含量。important EM associated methods¾¾¾

9、;TEM immunohistochemistry :locating proteinTEM Cytochemistry：MPO，CMPEM in-situ hybridization：locating mRNAImmuno-gold labeling for EM91971年由Faulk菌表面抗原的定aylor首次用于沙门氏杆研究。9胶体金性抗速而稳定地与蛋白质结合，特异葡萄球菌A蛋白，各种酶，凝集素等与胶体金结合后，不影响它们的活性，因此可以定位相应的抗原。Characteristics1.胶体金是氯金酸(HAuCl4)的水溶胶颗粒胶定位比酶反应物精确。金容易和多种大分子物质、包括抗2.体

10、、A蛋白、凝集素等结合。可制备不同直径（3-150nm）的胶体金颗粒；不同大小颗粒可在同-标本片上显示两种或多种抗原，即双标记或多标记。3.Procedure and steps固定：保留结构但不影响抗原，F4，F4G0.1包埋：树脂水溶性，K4M ，LR，紫外线低温，聚合。免疫组化：切片后操作与光镜相同。常用间接法标记。铀，铅染色。.1.1%正常羊血清30分钟RT2. 一抗12小时RT3.PBS洗涤RT3分钟，5次4. 胶体金二抗10秒1次30分钟1次;DW洗Examples- tumor ECMFIBRONECTIN细胞核内组蛋白Ultrastructural Localiz

11、ation of Antigenic SitesTEM Cytochemistry（1） 偶氮偶联法：含萘酚底物在酶作用下释放萘酚，与重氮盐结合，形成沉淀。重氮盐类有坚牢蓝紫酱GBC、坚牢蓝B、六异性酯酶（2）联偶付品红等。中性粒细胞碱性磷酸酶染色、特色、非特异性酯酶染色、酸性磷酸酶染色等。：用于过氧化物酶染色。粒、单细胞含髓过氧化物酶分解过氧化氢释放新生态氧，使联苯胺氧化形成沉淀。（3）普形成亚蓝反应：细胞内外铁与酸性亚铁氰化钾作用，氰化钾蓝色沉淀，如铁染色。（4） 雪夫反应二醛基，醛基碘酸氧化细胞内糖类的乙二醇基形成乙夫试剂作用，使无色品红形成沉淀物。（5） 金属沉淀法：某些金属化合物有颜

12、色，形成沉淀后可以显示相应物如钙钴法中性粒细胞碱性磷酸酶染在电镜下形成高电子密度区。色。沉淀Examples1.3Routine methods for blood cellresearch¾¾¾¾Sample for Ultrastructural analyzing Sample for Peroxidase analyzing Myeloperoxidase (MPO)Platelet peroxidase (PPO)常规血细胞透射电镜标本制备将3-4ml抗凝骨髓液或静脉血用吸管吸出，置于等量淋巴细胞分离液上部，直角离心机内离心10min（1500

13、r/min）。将有核细胞层转移至1.5ml的EP管内，用离心5min（ 500r/min）。去面血浆，加2.5%戊1%OsO4后固定。醛固定30min（4）。蒸馏水清洗标本2遍，然后30%、70%、90%、100% 乙醇或环氧丙烷各脱水10-15min（100%乙醇或环氧丙烷脱2遍）.1:1环氧丙烷和包埋液混合液浸透标本30min-2h，然后用包埋液浸透2h，然后换纯包埋液在烤箱中聚合（60，24h）过氧化物酶电镜组化标本制备分离有核细胞后，加孵育液混匀，转移至棕色7孵箱内孵育1h.小玻璃瓶内，放台式离心剂离心 min（1500r/min），弃上清液后加血浆混匀，再次离心，去血浆，加2.5%戊

14、二醛固定30min（4）孵育液配置：AB1mgDAB + 0.5ml 0.2mol的ringer/tries缓冲液900mlDD水 + 100ml双氧水。以1mol的氢氧化钠溶液调A液PH为7.5后,将B液加入A液中(35l:1.5ml比例)Significance of peroxidase reactionl MPO用于鉴别ALL 和AMLl PPO用于诊断AML-M7l 杂合白血病的诊断l AML-M0诊断z析系细胞分化程度Part 2 blood cell ultrastructure2.1 General cellular ultrastructure2.2 Observation

15、steps2.3 Blood cell observation2.1 General cellular ultrastructure胞质微丝7nm，长1um，主要是肌动蛋白，内。肌原性细胞内粗微丝呈专性细微丝：直径存在于各种细耦联存在。粗微丝：直径10-14nm，长1.5um，成分主要是肌动蛋白，肌源性细胞。中间丝：9-12nm，很长，成束存在。又分张力丝（鳞癌）、胶质丝（星形细胞、少突胶质细胞肿瘤）神经丝（神经元的肿瘤）等。颗粒分泌性颗粒胰岛细胞瘤分泌颗粒神经内分泌颗粒黑色素颗粒，非黑色素细胞内。角化透明颗粒：高分化鳞癌细胞内。粘液颗粒及原纤维性粘液颗粒：粘液腺上皮细胞内， 后者多见于宫颈腺

16、癌。Weibel-Palade小体：内皮细胞特异性颗粒Auer小体：粒细胞溶酶体：单核巨噬细胞肿瘤及颗粒细胞瘤。.9.10. 前列腺颗粒：前列腺癌细胞内。2. 2 Observation steps1 先低倍总览，高倍细勘。2 细胞外形及细胞间连结、排列方式。3 细胞内高尔基复合体、大小泡、分泌颗 粒、代谢产物、细丝、微管、中心粒的排列及数量。4 胞质中膜系统变化。5 核、核仁及它们的相关结构。6 细胞与间质间的关系。血细胞诊断结构zzzz细胞外形及胞膜，丝足和片垂核与核仁形状，常/异染色质比例内质网，分泌泡，表面囊泡颗粒形状和数量¾初级颗粒：粒细胞

17、90;次级颗粒：粒细胞¾Auer body(奥尔小体)：粒细胞¾巨核细胞颗粒¾单核细胞颗粒注意事项.5.标本采集要“准确”、“新鲜”。了解临床相关资料。熟悉正常组织细胞超微结构。避免以一两种超微结构片面解释。结合光镜，综合判断。Point 3 Development of blood cell正常红细胞发育阶段和形态Ø 原红细胞（proerythroblast）Ø 早幼红细胞 （basophilic normoblast）Ø 中幼红细胞（polychromatic normoblast）Ø 晚幼红细胞（orth

18、ochromatic normoblast）Ø 网织红细胞（reticulocyte）原红细胞proerythroblast or pronormoblast直径 14-19um, 原形或卵原形细胞核占细胞80%， 核膜清晰，核仁大。Giemsa 染色胞浆噬碱， Hb 含量少。胞质和核质比原粒和淋巴母细胞均匀，有颗粒感，线粒体大。proerythroblast or pronormoblast-EM早幼红细胞basophilic normoblast直径12-17um。核仁边界清晰，染色质边集，常染色质与副染色质对比明显。胞浆核糖体多，噬碱性增强，甚至超过原红细胞。血红蛋白增加，胞浆

19、密度增高。basophilic normoblast-EM中幼红细胞lychromatic normoblast细胞直径12-15um。 核进一步变小，直径7- 9um，染色质更浓集，核仁变小。胞浆出现淡红色血红蛋白为标志，干燥固定染色分布于核周区域；早期阶段胞浆线粒体丰富，随着血红蛋白的增多，线粒体的数量逐渐减少。polychromatic normoblast-EM晚幼红细胞（orthochromatic normoblast）最小有核红细胞，直径8- 12um。核固缩，色质凝集，缩块儿状，染布，呈花蕾样、花瓣状、三叶草状、双球样。胞浆充满血红蛋白，晚幼红细胞与成熟红细胞染色相同，其强噬酸

20、性区别于中幼阶段多染色性红细 胞。orthochromatic normoblast-EM网织红细胞（reticulocyte）Reticulocyte-EM粒细胞发育阶段和形态结构¾¾¾¾¾¾髓母细原粒细胞(myeloblast)早期早幼粒细胞(promyelocyte) 中幼粒细胞（myelocyte ）晚幼粒细胞（metamyelocyte）杆状与多形核粒细胞 (band and PMN)髓母细胞结构与干细胞难以区别，直径4-5um，圆形，核圆，异染色凝集胞浆少 细胞器少原粒细胞(myeloblast)直径8um左右。核圆，胞浆

21、少，核膜清晰， 异染色质少， 天蓝色核仁，异染色质少，核质细致。胞浆无颗粒，白血病细胞有MPO阳性颗粒，噬碱性核蛋白使胞浆蓝染，线粒体多而小，rER少，无Golgibody和颗粒。Myeloblast-EM早幼粒细胞(promyelocyte)直径，12-15。核与原粒核相似，圆或卵圆, 染色质分布与原粒细胞相同，后期染色质沿核膜凝集， 核仁清晰。胞浆增多，rER丰富， 出现分泌囊泡和大量初级颗粒，无次级颗粒，颗粒量少难以用光镜发现。promyelocyte-EM中幼粒细胞（myelocyte）直径12-15um核偏一，一侧扁平，染色质变粗核仁变小，光镜下难以发现，电镜下可以看到。胞浆含大量次

22、级颗粒，呈现粉红色毛玻璃样背景，初级颗粒停止产生，后期细胞rER减少，导致胞浆噬碱性下降，线粒体较小，数目明显减少。myelocyte-EM晚幼粒细胞metamyelocyte杆状与多形核粒细胞(band andPMN)直径12um，染色质凝集，杆状细胞核呈香肠样或条带样，多形核分叶2-5个色质联丝。胞浆，特殊颗粒为细粗细相其间有深紫红小粉红色颗粒，使胞浆呈毛玻璃背景，于其前体细胞相比，初级颗粒颜色变浅。胞浆中出原团快儿，细胞的阿米巴运动能力进一步加强。band and PMN-EM单核细胞的发育和形态结构Ø 原始单核细胞(monoblast)Ø 幼稚单核细胞(promon

23、acyte)Ø 单核细胞(monacyte)Ø 巨噬细胞(macrophage)原始单核细胞(monoblast) 直径10um，核圆，染色质细致，1个核仁。 胞浆噬碱，线粒体小，多聚核糖体弥漫，rER长条状，Golgi体少或小。 生理存在于骨髓，粒与单有共同干细胞，光镜难分辩，电镜对原粒和原单的鉴别也比较困难。体外培养最为可靠。 无黏附玻璃或塑料能力。Monoblast-EM幼稚单核细胞(promonacyte)直径12-15 um，表面有突起与伪足，与细胞运动和内吞相关。可辨认。核不规则，有切迹，染色质细致，核周微丝，可有核仁。 胞浆量多，噬碱，非特异性脂酶、MPO及溶

24、菌酶阳性，吞噬细菌和IgG吸附的红细胞。胞浆rER和Golgi体明显，多聚核糖体弥漫分布；有颗粒和囊泡，早期颗粒含有过氧化物酶、芳基硫酸酯酶和酸性磷酸酶。Promonacyte-EM成熟单核细胞直径12um，核马蹄形，光镜下核仁不明显，电镜下50% 单核细胞有核仁，核膜周围染色质粗重，为颗粒状或团快儿状。胞浆多，灰色或灰蓝色，许多细小淡紫色囊泡和细小尘沙样颗粒使胞浆呈灰兰色毛玻璃样，颗粒椭圆或长形， Golgi 体发达。附着玻璃与塑料能力强，1- 3小时内伸出细长的伪足和突起。One segmented neutrophil and 1 monocyte. Note differences i

25、n chromatin and cytoplasm color.Normal blood, 100XMonocyte-EM巨噬细胞(macrophage)直径15-50um，外形不规则，伪足多，为异质性细胞群体。核不规则，深切迹，核膜清晰。 胞浆天蓝色，含粗糙嗜天青颗粒和空泡。与单核细胞不同，巨噬细胞氧化物酶存在于rER和Golgi，颗粒缺乏过氧化物酶，颗粒同时存在过氧化物酶细胞，为中间型巨噬细胞，是刚从血液迁移到组织的单核细胞。Macrophage-EM巨核细胞的分化阶段和形态结构¾期巨核细胞¾期巨核细胞¾/期巨核细胞¾血小板期巨核细胞占骨髓巨核细胞2

26、0%，直径在6-24um。核大，切迹浅而少，异染色质少，多个核仁， 显著特征是核内有丝分裂。染色体为正常8-128 倍。胞浆稀少，噬碱性，线粒体、Golgi体和-颗粒量少， 核糖体丰富也称原巨。分界膜开始发育。One megakaryoblast with a prominent clear staining golgi area. Normal marrow - 100X期巨核细胞占25%，直径14-30um。核分叶状，染色体为8-64 倍。胞浆丰富，噬碱性减弱。大量-颗粒、细胞器,分界膜扩大，含微管微丝网状系统。期分化到、期需要72小时，分界膜系统增长25倍。核内有丝分裂从 期到期巨核细胞

27、分化完成前停止。Intermediate stage megakaryocyte. Normal marrow - 100X期巨核细胞/期巨核细胞占骨髓巨核细胞一半， 直径40-60um，核质比例小。胞浆噬碱性减弱，分界膜更加明显，细胞周边空白区，rER和Golgi体逐渐消失。期巨核胞浆碎片形成血小板，一个细胞产生1000-5000 个血小板，部分巨核细胞在肺组织产生血小板。One normal mature megakaryocyte. Normal marrow -50Xmegathrombocytes and plateletsplatelets -颗粒 致密小体 包裹小泡 线粒体 糖原

28、。淋巴细胞形态结构¾¾¾¾淋巴细胞的形态结构淋巴细胞的运动淋巴母细胞转化浆细胞形态结构淋巴细胞形态 小淋巴细胞：直径6-8um，表面光滑，绒毛和伪足少，细胞器稀少，核切迹处可见中心粒，游离核糖体多，多聚链少， 溶酶体少，异染色质多，中央少，一个核仁。对应未分化或正常淋巴细胞。 中等淋巴细胞：直径8-10um，胞浆增多，异染色质少，外观细致，Golgis体R增多，发育高，多聚游离核糖体多，rER 长，与核膜平行。对应中度分化淋巴细胞。 大淋巴细胞：也叫淋巴母或原淋细胞，直径10-12um，染色质疏松，核圆，核仁大，呈网眼样，约占核面积1/3，多聚核糖体丰富

29、，很少见到扩张的rER。对应病态巨幼样变淋巴细胞三种淋巴细胞光镜形态三种淋巴细胞电镜形态淋巴细胞的运动1931年Lewis：胞体翼侧形成一个沟槽环绕，细胞形成尾足，沟槽加深，核被环行结构挤向前方产生运动， 形状呈手镜或梨形， 速度大约20um/min。随细胞的活化程度增加，大比小快。细胞转化时运动增强，尾足也是细胞间发生反应和吞噬外源性物质的部位，是活化的表现，尾足包含Golgi体、线粒体、微丝和微管等各种细胞器，有DNA合成。淋巴细胞运动保持手镜样结构，以稳定和均匀的方式向前移动。原粒细胞是一种蜿蜒的蠕虫样运动。单核细胞运动时不断变化其形态和方向。手镜样淋巴细胞运动状态淋巴母细胞转化浆细胞样变zmitogen激活淋巴细胞被称做母细胞转化，B细胞分化为富含rER的浆细胞；T细胞变成的母细胞形态不同，胞浆丰富，细胞器较多。z植物凝集素（PHA）可激活T淋巴细胞；商陆丝裂原（PWM）在T细胞存在时激活B细胞分泌Ig。丝裂原与恰当受体结合，激活起始，随后发生交联和受体重新分布。浆细胞样淋巴细胞浆细胞的形态结构l 圆形或卵圆形，直径10-30um之间，胞浆丰富，噬碱性强，深蓝色。核周有含Golgi体的明显淡染区；核