TRAP聚合酶链反应-酶免疫间接定量法测定鼻咽癌中端粒酶活性

1、    TRAP聚合酶链反应-酶免疫间接 定量法测定鼻咽癌中端粒酶活性        摘要：目的探讨TRAP PCR-ELISA间接定 量法测定鼻咽癌(NPC)中端粒酶(TLMA)的表达。方法采用TRAP PCR ELISA 法测定了18例NPC组织、4例癌旁组织、4例慢性鼻咽炎组织及22个NPC HNE1细胞株、5例白 血病骨髓细胞及2例正常骨髓细胞、6个血管平滑肌细胞株中TLMA的表达。并测定了不同浓度 HNE1细胞株及NPC灭活标本中的TLMA活性。结果NPC

2、活检组织、癌旁组织 有较高的TLMA表达，而慢性鼻咽炎组织为阴性(P0.01)。NPC HNE1细胞株、白血 病骨髓细胞中亦有较高的TLMA表达。在102HNE1细胞株中亦能检测到TLMA活性。而2种正 常对照细胞为阴性。灭活后NPC标本中TLMA全部为阴性。结论无论在NPC体 内、体外试验中均有较高的TLMA表达。该定量法特异性好、灵敏度可达102细胞，具有易 出结果、可靠、准确、能够反映不同程度的TLMA活性状态及与PAGE电泳有较好的一致性等 优点。关键词：端粒酶；鼻咽癌；定量实验方法中分类号：R739.6文献标识码：A文章编号：1000-8578(2000)-03-0207-03 Te

3、lomerase Activity in Nasopharyngeal Carcinoma Detected With TRAP PCR ELISA Indirect Quantitative AssayWEN Zhong,XIAO Jian-yun,TANG Fa-qing,et al（Department of ENT,Xiangya Hospital,Hunan Medical University,Changsha 410008，China）Abstract:Objective To detect the expression of telomerase with TRA P PCR

4、ELISA indirect quantitative method in nasopharyngeal carcinoma(NPC). Methods Telomerase activity was detected in 18 cases of NPC,4 cases of the epithelium adjacent to NPC and 4 cases of chronic nasopharyngitis with TRAP PCR ELISA indirect quantitative method.At the same time,the activity of telomera

5、se i n 22 HNE1 cell strains,5 cases of Leukemia marrow cells,2 cases of normal mar row cells and 6 vasculor smooth muscle cell strains as well as in the HNE1 cel l strains of different concentration and NPC after hot inactivating was also exp lored.Results The telomerase activity in NPC and the epit

6、helium adja cent to NPC reached at 1.03±0.88U and 1.0±0.59U respectively compared wit h 0.16±0.06U in chronic nasopharyngitis (P0.01).There also was a high er telomerase activity in HNE1 cell strains and leukemia marrow cells than in normal marrow cells and vascular smooth muscle cell

7、 strains (P0.01).Exp eriments showed that the telomerase activity of NPC after hot inactivating was l ost and detection of the telomerase activity could also be got at a concentratio n as small as 1×102HNE1 cells/ml.Conclusion There is a high te lomerase activity in NPC in vivo and in vitro.TRA

8、P PCR ELISA indirect quantitati ve assay has many advantages such as high sensitivity,specificity and reliabilit y and is able to reveal and compare different activity status of the telomerase. Key words:Telomerase;Indirect quantitative assay;carcinoma;Nasopha ryngeal端粒酶(Telomerase,TLMA)被认为与细胞永生化、恶性

9、变有密切关系。自Kim NW等1首次采用TRAP(Telomeric Repeat Amplification Protocol)法测定肿瘤 细胞株中TLMA活性以来，人们已经逐步认识到TLMA在肿瘤发病中的重要性。Rhyu MS 2总结人体13种不同部位的400多种恶性肿瘤的TLMA，其总的阳性率达84.8%。在肿瘤 细胞株中的阳性率达98%1。以上定性法虽然对反映TLMA表达有其特殊价值，但 也有一定的局限性，比如：不容易比较不同程度的TLMA阳性状态，对不清晰的聚丙烯酰胺(P AGE)凝胶电泳较难分辨TLMA的真实活性。对此，我们采用TRAP聚合酶链反应-酶免疫(PCR ELISA)间接

10、定量法对鼻咽癌(NPC)TLMA活性进行了检测。1材料与方法1细胞株由我校肿瘤研究所提供。用常规RPMI 1640培养基(含15%小牛血 清)，饱和湿度及5%CO211-TS：5?AATCCGTCGAGCAGAGTT-3;P26、105、104 、103、102ml等不同浓度HNE1细胞株中TLMA活性及对10个HNE1细胞株及5 例NPC采用热灭活试验(86°C，10min热水浴)后的TLMA活性。2结果2.118例NPC TLMA测定结果见表1。表1鼻咽癌、癌旁及慢性鼻咽炎TLMA测定的光密度(OD)值结果分组nOD值(U)±st检验鼻咽癌181.03±0.8

11、8与，与癌旁组织41.0±0.59比较P0.01慢性鼻咽炎40.16±0.062.222例NPC HNE1细胞株TLMA活性测定结果见表2。 表222例HNE1细胞株中TLMA表达的OD值结果 分组nOD值(U)±st检验HNE1细胞株220.73±0.26与、白血病骨髓细胞50.70±0.24比较P0.01正常人骨髓细胞20.07±0.01与、血管平滑肌细胞株60.19±0.14比较P0.012.310个HNE1细胞株及5例NPC标本灭活后TLMA表达结果见表3。 表310个HNE1细胞株及5例NPC标本灭活 后TLMA表

12、达结果分组nOD值(U)±s配对t检验NPC灭活前51.08±0.79NPC灭活后0.12±0.08P0.05HNE1灭活前100.74±0.27HNE1灭活后0.14±0.07P0.052.4不同浓度NPC HNE1细胞株TLMA表达结果见表4。 表4不同浓度HNE1细胞株TLMA表达结果分组(/ml)OD值(U)±s1060.98±0.291050.86±0.191040.76±0.241030.70±0.331020.45±0.163讨论TLMA是由RNA和蛋白质组成的一种特殊逆

13、转录酶，它可依自身RNA为模板，逆转录合成端粒(T elomere,TLM)DNA,对维持染色体两端TLM长度并进而维持染色体的稳定发挥重要作用。Kim N W首创TRAP定性法测定TLMA活性。德国宝灵曼公司在此基础上引入ELISA，将TLMA活性转化成 光密度(OD)值，从而可以定量分析TLMA的活性(试剂盒规定OD值0.20U为阳性)。本试验 首次采用TRAP PCR ELISA试剂盒测定了NPC及NPC HNE1细胞株中TLMA的表达。结果发现在N PC标本、癌旁组织中均有较高的TLMA活性，而在慢性鼻咽炎组织中全部为阴性。在NPC HNE 1细胞株、白血病骨髓标本中亦有较高的TLMA

14、活性，而在正常细胞中为阴性。经统计学分 析有显著性差异。说明TLMA像在其它多数人体恶性肿瘤细胞出现高表达一样，无论在NPC体 内、外试验中均有较高的活性。以上TLMA在人体各种恶性肿瘤的特异性高表达可能说明了恶 性肿瘤发病的共同机制。为了检验PCR-ELISA间接定量法测定TLMA的特异性及灵敏度，本试验同时进行了热灭活试验 及 测定了几种不同浓度HNE1细胞株中TLMA活性。结果显示，经灭活后所有样本TLMA活性均转 为阴性。TLMA测定的灵敏度可达102细胞/ml。我们认为，TRAP PCR ELISA间接定量法测定TLMA活性具有方法简便，结果可靠，易于比较不 同程度的TLMA活性状态

15、，尤其是对定性法显示出的弱阳性或PAGE电泳显示不清晰的情况下 ，间接定量法更能准确表达TLMA的活性状态，也便于分析测定方法的灵敏度、特异性。与同 时进行的PAGE电泳方法比较，也具有良好的一致性。 基金项目：本课题为湖南省科委基金课题，并受到国家自然科学基金的资 助(NO：98ssy1008(2),NO.39770933)作者单位：文忠（410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院耳鼻咽喉研究室）肖健云（410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院耳鼻咽喉研究室）唐发清（410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院耳鼻咽喉研究室）田勇泉（410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院耳鼻咽喉研究室）赵素萍（410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院耳鼻咽喉研究室）文忠（410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院中心实验室）肖健云（410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院中心实验室）唐发清（410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院中心实验室）田勇泉（410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院中心实验室）赵素萍（410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院中心实验室）参考文献：1Kim N.W.,Piatyszek M