D半乳糖诱导衰老动物模型研究进展

1、D?半乳糖诱导衰老动物模型研究进展    中国    作者：许扬 吴涛 顾佳黎 傅正伟 【关键词】 D?半乳糖；衰老模型；氧化应激；线粒体；高级糖基化终产物在上世纪60年代发现半乳糖会对鸡脑中能量和磷脂代谢产生有害影响1。1985年， 中国 学者徐黻本首次提出给予啮齿动物D?半乳糖（D?gal）可以诱导类似于加速衰老进程的生理变化2。近年来，伴着该模型被大量深化研究，其致衰老的作用机制也渐为明了，这为这一动物模型的广泛应用奠定了坚实的理论基础。研究发现，经过长期D?gal诱导而导致的模型动物寿命缩短主如果由于氧化应

2、激所致，引起线粒体、神经损伤，进一步表现为认知能力下降。另外，该模型具有衰老相关的高级糖基化终产物（AGE），并且出现免疫力下降等一系列类似 自然 衰老的变化。本文简要地综述了?gal半乳糖诱导衰老动物模型的研究进展及其可能的应用领域。 1 半乳糖的主要代谢途径 半乳糖是动物体内的正常代谢产物。哺乳动物从乳糖中获得半乳糖，乳糖在体内水解生成葡萄糖和半乳糖，而半乳糖则在肝脏中飞快被酶解成葡萄糖。半乳糖代谢异常会引起动物生理功能显著变化。半乳糖血症是一种染色体隐性遗传的糖类代谢异常疾病。体内半乳糖及其代谢物浓度异常降低所致代谢障碍使患者的肝脏、肾脏、脑组织和晶状体成为主要受累器官，可引发白内障、肝

3、肿大、肝硬化等并发症。鉴于半乳糖代谢的特点，研究者通过大剂量D?gal的给予而造成动物糖代谢紊乱，成功地建立了具有特别研究目的的动物模型。 2 D?gal诱导衰老动物模型的研究 2.1 寿命缩短 根据Hayflick极限，成纤维细胞在体外可传代的次数与物种的寿命有关，其分裂能力与个体的年龄有关。崔旭等3观察到D?gal使大鼠胎脑神经元出现生长发育缓慢、突起脱落、死亡率增高等退行性变；大鼠肺成纤维细胞的体外分裂代数减少；人胎儿肺二倍体成纤维细胞分裂周期中G2?M期细胞减少、G?G1期细胞增加，细胞增殖速度减慢，由此可见D?gal抑制细胞生长发育和减少分裂次数，加速细胞衰老。有研究4通过Flow?

4、Fish法证明了D?gal能缩短乳鼠心脏成纤维细胞端粒的长度，进一步在细胞水平明确了D?gal加速衰老的作用。 Cui等5检测了D?gal对于果蝇和家蝇寿命的影响。在家蝇饮水中加入20 mg/ml的D?gal，发现其平均寿命雌雄分别减少19.8%和27.1%，最大寿命雌雄分别减少21.9%和27.1%。同样，在果蝇的培养基添加6.5%的D?gal也导致果蝇的平均寿命雌雄分别减少15.9和12.6，最大寿命雌雄分别减少17.1%和12.9%。由此可见，D?gal显著地导致了果蝇和家蝇平均寿命以及最大寿命的缩短。 2.2 氧化应激 自由基的氧化积累会损伤细胞内DNA、蛋白质、细胞膜脂质等大分子，致

5、使机体逐渐衰老6。个体的代谢率越高，自由基的氧化积累越快，由此造成的细胞损伤也越大，其寿命也就越短7。在D?gal诱导衰老模型中，过量的D?gal的给予导致了机体代谢率的提高，由此产生了由于自由基的增加而引起的一系列与氧化应激相关的病理生 理学 变化。如研究8发现D?gal处理导致家蝇和果蝇脑组织中丙二醛（MDA）和脂褐质(LF)显著增加，而超氧化物歧化酶（SOD）显著减少。研究9同样发现，D?gal暴露能引起啮齿类动物氧化应激损伤，如使小鼠血清和脑组织中MDA浓度增加，总抗氧化能力（ T?AOC）、T?SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH?Px）、谷胱甘肽（GSH）活性降低。另外，这种氧化应激

6、损伤与诱导的D?gal浓度有密切的关联，并具有器官选择性10。在1或5浓度的D?gal诱导下，小鼠血液和脑组织中的MDA增多，而SOD活性下降；但是在肝脏中，只有D?gal注射浓度达到5的时分，才检测到MDA增加，并且在两个浓度下肝脏中SOD相对于对照组均无变化。皮肤的氧化损伤也是衰老的重要标志之一。衰老的胶原交联学说认为伴着衰老胶原交联增加，会导致胶原敏感性降低，胶原的分解减少，弹性和韧性降低。皮肤中羟脯氨酸密度是胶原密度的间接标志。在D?gal模型小鼠皮肤中发现羟脯氨酸增加以及皮肤SOD活性下降11。综上所述，D?gal导致模型动物强烈的氧化应激反应，进一步引起氧化损伤而加速衰老的进程。

7、2.3 线粒体损伤 目前线粒体损伤学说已作为衰老学说的一个重点部分。由于线粒体DNA (mtDNA)缺乏组蛋白，复制快速且无校读功能以及缺乏有效的DNA修复机制，所以mtDNDA易受到自由基攻击，较易产生氧化损伤而引起突变，其突变率是核DNA的10倍。mtDNA损伤可导致线粒体功能缺陷，引起细胞衰老与死亡。研究发现在D?gal注射结合卵巢切除诱导的老年痴呆(AD)模型大鼠海马CA1区线粒体肿胀，扭曲，脊断裂12。自然衰老大鼠会发生与人类mtDNA 4 977缺失类似的mtDNA 4 834缺失，而人类mtDNA 4 977缺失导致老年性耳聋。研究发现D?gal诱导加速内耳衰老13，14，导致大

8、鼠不同组织以及血液样本中发生mtDNA 4 834 bp缺失的突变率很高。自然衰老小鼠线粒体外膜上的外周型苯二氮卓受体(PBR)与其阻滞剂3HPK11195结合会减少，二者结合活力下降反映线粒体功能受损15，而长期注射D?gal导致SD大鼠海马突触中PBR与3HPK11195特异结合减少，且无性别差异16。 2.4 神经损伤 氧化应激造成的神经毒性也是导致衰老的一个因素17。D?gal诱导AD模型大鼠12海马有淀粉状蛋白免疫反应物，胆碱能神经元丢失。AD生物标志物神经纤维纠缠，星形神经胶质细胞纤维紧密聚集成束，突触退化，出现髓样体。此外D?gal模型鼠海马中微管相关蛋白（Tau?2）磷酸化增加

9、，神经生长因子（NT?3）减少9。NeuN/BrdU双重着色发现D?gal的诱导并不仅仅是减少粒细胞下层(SGZ)中的神经元前体的增殖，并且减少粒细胞层(GCL)新神经元的迁移和存活。因此，研究者推测长期注射D?gal会导致神经损伤，加速衰老，其原因可能是增强caspase介导的细胞凋亡，抑制了神经发生和迁移，同时增加了氧化损伤8。 除了上述提及的D?gal模型动物海马区线粒体等损伤以外，造成D?gal模型动物神经损伤的原因还可能是氧化压力伴伴着胞质Ca2+的平衡失调18。Ca2+通过L?型钙离子通道大量流入，造成神经损伤，进一步造成AD和加速衰老进程19。运用荧光染料fura?2AM检测到D

10、?gal衰老小鼠海马和大脑皮层突触内的自由Ca2+水平降低20；用原位杂交检测发现其生长关联蛋白(GAP43)mRNA表达降低。而GAP43是调节神经突生长和再生的因子，其表达水平可以作为评价神经传入阻滞等衰老相关的指标21。 2.5 认知能力 D?gal引起认知能力的变化是一系列反应的最终体现。长期注射D?gal引起氧化应激，进而导致线粒体损伤，神经退性变形，然后会引起动物认知能力下降。近年来学者用Morris水迷宫(MWM)、目标辨认测试（ORT）、运动行为测试（LAT）、旷场行为、自发性运动、穿越测试、Y迷宫和强迫逃避等行为测验检测了D?gal诱导衰老模型动物的学习、认知、活动能力，发现

11、D?gal处理的动物各项表现明显变差。如在MWM测验时，研究发现D?gal注射导致其空间记忆障碍，逃避反应工夫和游泳的途径都比对照组长8，20，雌雄鼠均出现了显著的空间记忆障碍16。另外，D?gal诱导的认知能力下降与其运用的剂量有肯定的相关性。WEi11等探讨了诱导小鼠衰老模型时D?gal运用的不同剂量，他们分别运用50、100、200 mg/kg体重的剂量每天给小鼠皮下注射用药。MWM和ORT监测发现在50100 mg/kg体重范围时其学习和记忆功能障碍程度与运用剂量成正比，而当剂量100 mg/kg体重时上述相关性就不再存在。 2.6 其他 D?gal诱导衰老模型动物体内检测到了AGE。

12、D?gal是一个还原糖，易与蛋白质或多肽的游离氨基反应生成AGE，这个过程也叫做Maillard反应22。AGE在衰老进程中不断积累和很多老年性疾病的发病机制相关联，比如糖尿病，动脉硬化，肾病和AD。当蛋白质被AGE修饰，会导致大量自由基产生。AGE会增加氧化应激，增加异常的磷酸化作用，影响学习记忆功能。用定量ELISA发现D?gal模型小鼠血清中AGE含量是对照组的2.5倍，因此，D?gal注射使得小鼠血清中AGE水平降低，可加速老化，提示AGE与D?gal诱导加速衰老相关联23。无论是人类或者动物，衰老都与免疫能力的下降相关。而在D?gal模型小鼠脾脏中发现淋巴细胞增殖（有丝分裂发生）减少

13、，白细胞介素?2（IL?2）产生减少23，24。这进一步提示D?gal诱导衰老模型类似于自然衰老。 3 D?gal诱导衰老的机制假设 通过对以上研究的综合分析，提出以下D?gal诱导衰老的假设机制：首先，D?gal代谢主要在肝脏组织，在体内醛糖还原酶作用下，生成醛糖醇和H2O2，半乳糖醛醇不能进一步被代谢，积累过量使细胞浸透压降低，脆性增加，细胞损伤，而H2O2的大量生成导致胞内氧化应激增加；半乳糖代谢相关氨基酸糖D?氨基半乳糖胺，也主要在肝脏代谢，过量存在也会导致尿嘧啶核苷耗竭及肝脏转录功能障碍；如果代谢中间物半乳糖?1?磷酸过量积累会使肝脏中无机磷酸盐储存耗竭，也导致肝损伤。其次，研究发现

14、D?gal如果大量存在，会直接进入晶状体产生沉积并诱发白内障。再次，由于Maillard反应的存在，D?gal会使大量脂类和蛋白质糖基化，产生AGE，进而导致氧自由基增加，机体氧化压力增高，最终引起细胞老化。最后，也有学者认为D?gal通过羰?氨反应，形成交联产物，通过羰基毒化机制使动物体内蛋白质功能丧失，进而引起一系列的衰老改变。目前，对于D?gal诱导衰老模型的研究发现，伴着各途径导致的氧自由基增多，机体蛋白质，脂质和DNA的氧化损伤加重，其中特别是mtDNA突变而导致线粒体损伤，进而加速衰老进程，是目前衰老学说的一个热点。 4 D?gal衰老模型动物的应用 D?gal诱导衰老动物模型，在

15、生理、生化指标各个方面类似于自然衰老，因此该模型目前广泛应用于筛选药物以及评价具有延缓衰老功能的保健食品。 在药物筛选方面，经典藏药凹舌兰提取物9能明显改善D?gal致衰老小鼠认知障碍，脑组织氧化损伤，海马神经损伤状况。中草药根提取物川牛膝多糖23（ABP）和枸杞多糖能抑制D?gal导致的衰老小鼠血清和皮肤非酶糖基化，而且川牛膝多糖比枸杞多糖具有更强的抗衰老作用。新鲜地黄根部的提取物梓醇25是一种环烯醚萜糖苷，它能提高D?gal诱导的小鼠在MWM的学习记忆能力，增加大脑皮层和海马抗氧化酶活性，抑制自由基再生。 在具有延缓衰老功能的保健食品的评价方面，抗氧化剂和神经保护剂?硫辛酸8 (?Lipoic Acid) 的保护作用可以减少D?gal致衰老小鼠氧化应激损伤情况。每天服用5或10 mg/kg类黄酮物质槲皮黄酮20可以使脑组织中MDA