细胞治疗实验室工艺流程2

1、细胞治疗实验室工艺流程2细胞治疗实验室工艺流程细胞治疗实验室工艺流程按种类分为：一、试剂耗材入库记录，试剂耗材使用记录，试剂配制记录, 配制的试剂使用记录。入库需要记录产品的名称、批号、有效期、数量、存放 位置、入库时间。试剂耗材使用记录包括名称、批号、用途，时间。时间、试剂配制记录包括原料的名称、批号，配制试剂的 有效期、批号。配制的试剂使用记录包括使用的时间、批号、用途。二、实验记录，包括采血、分血、细胞接种、补液、质检、回输。采血有2个信息实验室需要记录，包括浓缩白细胞体积和 血浆体积。分血有需要记录使用的分离液的量和单个核细胞数量。细胞接种需要记录 DC CIK、CD3AK 丫 3 T

2、、NK等细胞接种数量、培养基体积、细胞因子添加的量。补液需要记录补液的时间和体积。质检需要做细菌真菌培养、内毒素检测、革兰氏检测, 录做这些质检的时间。回输需要记录回输的细胞种类、时间、细胞体积、细胞数三、细胞检测记录，包括细菌真菌培养，内毒素检测，革兰 氏检测，流式检测。记录内容包括样品的来源、检测时间、结果、检测人。四、清洗消毒记录。包括清洗消毒的时间、方式、消毒有效期。细胞培养流程图MBj 细胸接=珅4U1UUDC细胞CIK细胞CD3A监田胞T ST细NK细胞其它细胞F11根据细胞生长情况补液根据细胞生长情况补液根据细胞生长情况补液2小时后 洗版第2天加CIK混合 因子卜第5天加成熟剂1

3、UKU回输前3 天细菌真 菌培养回输前3 天细菌真 菌培养回输前3 天细菌真 菌培养根据细胞生长情况补液T u.第6天加成熟剂2_I1回输前12 小时革兰 氏染色回输前12 小时革兰 氏染色回输前12 小时革兰 氏染色回输前3 天细菌真 菌培养F第7天收 细胞，计算 细胞存活 率、细胞数 后冻存或 回输回输前12 小时革兰 氏染色计算细胞 存活率、细 胞数后给计算细胞 存活率、细 胞数后给计算细胞 存活率、细 胞数后给NO采血日期：自体细胞制剂制备记录姓名年龄性别科室病案 号主营 医生床号传染 扃临床 诊断病理 切片患者基本情况细胞制备标准操作记录分血数量单位日 期操 作 人复 核 人备注自体

4、血浆体积mlm细胞体积mlF二icol体积ml批号：PBMC、量x 109DC细胞制备数量单位日 期操 作 人复 核 人备注1、PBMC1 量x 1082、铺瓶（板）瓶 （板）3、： 体秒加 dcWfMml4、DC诱导因子（100X）ml批号：5、第二 成熟剂反天加DC1 (100Xml批号：6、第六天补加DC成熟剂2 （100X）ml批号：7、第七（八）天X 107收集DCCIK细胞制备数量单位日 期操 作 人复 核 人备注1、1添加IFN-rIU2、PBMC1 量X 1083、：接种体积ml4、添加CIK混合 因子（100X）ml批号：5、补液第1次ml第2次第3次第4次第5次第6次CDA

5、K细胞制备数量单位日 期操 作 人复 核 人备注1、 添加CD3AK混合 因子（100X）ml批号：2、PBMC1 量X 1083、接种体积ml第1次第24、补液次ml第3次第4次第5次Y 8T细胞 制备数量单位日 期操 作 人复 核 人备注1、PBMC1 量X 1092、接种体积ml3、 添加 丫 S T混合 因子（100X）ml批号：4、补第1次ml液第2次第3次第4次第5次NK细胞制备数量单位日 期操 作 人复 核 人备注1、PBMC1 量X 1082、接种体积ml3、添加NK 细胞混合因 子（100X）ml批号：第1次4、液补第 2次第 3次ml第4次第5次细胞冻存及复苏标准操作记录细

6、胞冻存标准操作记录“ 冻细冻存十, 一 1，一 存 一、，复日编胞细胞数量一存放操作期号类数量（支:位置人修 舍仕编人型)L号细胞复苏标准操作记录细复苏复复日 编胞细胞数量苏存放操作期号类数量（支用位置人修 舍仕人型) 途目体细胞制剂回输记录姓名年龄，二 rnu 性另科室病案号一床号次 数日 期细胞类型批号体积(ml)回输 方式运 送 人接收 人复 核 人123456789101112131415161718目体细胞制剂检控记录次 数细胞外观细菌真 菌革兰氏 染色细菌内 母素最终检定 结果存活 率数量操作 人复核 人回输 细胞 批号均匀悬 浊液，无 异物第一次回输前3 天每次回 输当天每次回

7、输当天需经检定合格后 方可回输存活 率85%11是否阳性 阴性阳性 阴性阳性阴性合格不合格2是否阳性 阴性阳性 阴性阳性阴性合格不合格3是否阳性 阴性阳性 阴性阳性阴性合格不合格4是否阳性 阴性阳性 阴性阳性阴性合格不合格5是否阳性 阴性阳性 阴性阳性阴性合格不合格6是否阳性 阴性阳性 阴性阳性阴性合格不合格7是否阳性 阴性阳性 阴性阳性阴性合格不合格8是否阳性 阴性阳性 阴性阳性阴性合格不合格9是否阳性阴性阳性阴性阳性阴性合格不合格10是否阳性阴性阳性阴性阳性阴性合格不合格11是否阳性阴性阳性阴性阳性阴性合格不合格12是否阳性阴性阳性阴性阳性阴性合格不合格13是否阳性阴性阳性阴性阳性阴性合格

8、不合格CIK细胞培养标准操作流程1、 溶液的配置1、热灭活自体血浆的制备：将自体血浆装在无菌的离心管内， 放入56摄氏度水浴锅内热灭活40分 钟，取出用2500转离心10分钟，取出上清备用。2、IFN-r母液（1000X）:用无血清培养基配成100万IU/ml。3、CIK混合因子（100X）:冰箱4度保存。4、CIK完全培养基：无血清培养基加1%-2喊灭活自体血浆。2、 CIK细胞制备：1、血细胞单采机采集病人浓缩白细胞和血浆（80-100ml）。2、准备2支50ml离心管，每管加入淋巴细胞分离液 20ml 03、将浓缩白细胞从血袋中取出，直接等量加到上述2支50ml离心管淋巴细胞分离液上面，

9、2000转离心25分钟，升降速调到最低值。4、取出上层的血浆收集到一支 50ml离心管中，余下的部分除红细胞外全部收集到 2支50ml离心管 中，加生理盐水到50ml, 1500转离心10分钟，去除上清，合并 2支管内的细胞到一支50ml离 心管中，加50ml生理盐水，取20ul样品用于计数，1200转离心7分钟，去除上清。5、所有的血浆留出12支5ml用于回输，其余全部56摄氏度灭活40分钟，灭活完成后2500转离心 10分钟，收集上清备用。6、将细胞用CIK完全培养基配成1X107ml ,加入IFN-r母液至1000IU/ml ,接种1个细胞培养袋， 袋内加200ml CIK完全培养基。7

10、、24小时后，按1:100加入CIK混合因子。8、第5天,按4倍稀释添加含300IU/ml IL-2 的CIK完全培养基。9、第8天到第9天，按2倍稀释添加含300IU/ml IL-2的CIK完全培养基。同时取样做细菌真菌 培养。10、 以后每隔一天按2倍稀释补一次液，第一次回输前 1天取样送检做革兰氏染色检查。11、 等拿到细菌真菌培养结果后，检查所有结果是否为阴性。CIK培养到第10天-15天内回输。12、 回输时收集细胞于离心管内，1200转离心7分钟，去除上清，收集细胞后加生理盐水再离心2次，1200转离心7分钟。13、 将收集到的细胞加入到150ml注射用生理盐水中，加入 5ml自体

11、血浆，2万IU IL-2 ,留1ml细胞悬液到1.5ml离心管中，4摄氏度存放3月备查。14、 将完成的细胞悬液封好瓶口，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病区及治疗项目，确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。DC细胞培养标准操作流程1、 溶液的配置1、热灭活自体血浆的制备：将自体血浆装在无菌的离心管内，放入56摄氏度水浴锅内热灭活40分钟，取出用2500转离心10分钟，取出上清备用。2、DC基础培养基：用无血清培养基+2班灭活自体血浆。3、DC诱导剂（100X）:冰箱4度保存。4、D*养基：DC基础培养基加入DC诱导剂4、DC成熟剂1（100X）:冰箱4度保存。5、DC成熟

12、剂2 （100X）:冰箱4度保存。2、 DC细胞制备：1、取PBMC加入IMDMt养基配成5X106/ml细胞悬液，按每孔3ml接种到6孔板内，放入培养箱。2、2小时后，取出，晃动去除上层杂细胞，留下贴壁的单核细胞（体积比其它细胞稍大），每孔加入3ml DC培养基。3、第5天，按每孔30ul加入DC成熟剂1,取样做细菌、真菌培养。4、收集细胞前12小时每孔加入30ul DC成熟剂2,同时取样送检做革兰氏染色检查。5、DC培养到第7-8天,收集细胞，用生理盐水洗 3次，分成4份，其中一份用于当天回输，其余 冻存在-80度冰箱中。6、将生理盐水清洗过的DC细胞加入到150ml注射用生理盐水中，加入

13、 5ml自体血浆，留1ml细胞 悬液到1.5ml离心管中，4摄氏度存放3月备查。7、将完成的细胞悬液封好瓶口，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病区及 治疗项目，确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。CD3A恺田胞培养标准操作流程1、 溶液的配置放入56摄氏度水浴锅内热灭活40分1、热灭活自体血浆的制备：将自体血浆装在无菌的离心管内, 钟，取出用2500转离心10分钟，取出上清备用。2、CD3AK合因子（100X）:冰箱4度保存。3、CD3A&全培养基：无血清培养基+1%-2%&灭活自体血浆+ CD3AK昆合因子2、 CD3AK田胞制备：1、PBMCffl CD3A位全培养基

14、配成1X106/ml ,接种培养瓶或培养袋培养。2、第5天，按4倍稀释添加CD3A炕全培养基。3、第8天到第9天，按2倍稀释添加CD3A位全培养基。同时取样做细菌真菌培养。4、以后每隔一天按2倍稀释补一次液，第一次回输前 1天取样送检做革兰氏染色检查。5、6、7、8、等拿到细菌真菌培养结果后，检查所有结果是否为阴性。CD3AK养到第10天-15天内回输。回输时收集细胞于离心管内，1200转离心7分钟，去除上清，收集细胞后加生理盐水再离心2次，1200转离心7分钟。将收集到的细胞加入到150ml注射用生理盐水中，加入 5ml自体血浆，2万IU IL-2，留1ml细胞悬液到1.5ml离心管中，4摄

15、氏度存放3月备查。将完成的细胞悬液封好瓶口，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病区及 治疗项目，确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。Y 8 T细胞培养标准操作流程一、 溶液的配置放入56摄氏度水浴锅内热灭活40分1、热灭活自体血浆的制备：将自体血浆装在无菌的离心管内, 钟，取出用2500转离心10分钟，取出上清备用。2、T 6 T混合因子（100X）:冰箱4度保存。3、完全培养基：无血清培养基1%-2呱灭活自体血浆。二、丫 6 T细胞制备：1、将PBMCH完全培养基配成2X107ml ,加入混合因子，接种培养瓶或培养袋培养。2、第5天，按2倍稀释添加含400IU/ml IL

16、-2 的完全培养基。3、第8天到第9天，按2倍稀释添加含400IU/ml IL-2 的完全培养基。同时取样做细菌真菌培养。4、以后每隔一天按2倍稀释补一次液，第一次回输前 1天取样送检做革兰氏染色检查。5、等拿到细菌真菌培养结果后，检查所有结果是否为阴性。丫6T培养到第10天-15天内回输。6、回输时收集细胞于离心管内，1200转离心7分钟，去除上清，收集细胞后加生理盐水再离心2次，1200转离心7分钟。7、将收集到的细胞加入到150ml注射用生理盐水中，加入 5ml自体血浆，留1ml细胞悬液到1.5ml 离心管中，4摄氏度存放3月备查。8、将完成的细胞悬液封好瓶口，核对病人姓名、性别、年龄、

17、住院号、细胞数、无菌结果、病区及治疗项目，确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。NK细胞培养标准操作流程一、 溶液的配置1、热灭活自体血浆的制备：将自体血浆装在无菌的离心管内， 放入56摄氏度水浴锅内热灭活40分 钟，取出用2500转离心10分钟，取出上清备用。2、NK细胞混合因子（100X）:冰箱4度保存。3、完全培养基：SCG比血清培养基+1%-2呱灭活自体血浆。二、NK细胞制备：1、将PBMCH完全培养基配成1X107ml ,加入NK细胞混合因子，接种培养瓶或培养袋培养。2、第5天，添加2倍量完全培养基，加入 500IU/ml IL-2 。3、第8天到第9天，按2倍稀释添加含500IU/

18、ml IL-2 的完全培养基。同时取样做细菌真菌培养。4、以后每隔一天按2倍稀释补一次液，第一次回输前 1天取样送检做革兰氏染色检查。5、等拿到细菌真菌培养结果后，检查所有结果是否为阴性。NK培养到第10天-15天内回输。6、回输时收集细胞于离心管内，1200转离心7分钟，去除上清，收集细胞后加生理盐水再离心2次，1200转离心7分钟。7、将收集到的细胞加入到150ml注射用生理盐水中，加入 5ml自体血浆，留1ml细胞悬液到1.5ml 离心管中，4摄氏度存放3月备查。8、将完成的细胞悬液封好瓶口，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病区及治疗项目，确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。细胞冻存和复苏标准操作流程一、溶液的配置1、程序降温盒的准备：按程序降温盒上的标示量加入250ml异丙醇作为冷冻液，室温放置。2、冻存液的配置：热灭活自体血浆加入 10% DMSO9、细胞冻存1、将要冻存的细胞离心1200rpm, 7min,去除旧的培养液。2、轻轻混匀细胞沉淀，加入适量配制好的冻存培养液，DC细胞调整细胞密度为5X 106/ml 2X107/ml ,每管冻存0.5ml