多聚阳离子对非病毒载体转移效率的影响

1、多聚阳离子对非病毒载体转移效率的影响摘要目的： 了解鱼精蛋白应用于血管内皮生长因子受体介导的靶向性非病毒载体的可行性。方法： 利用GV1，GV2靶向性非病毒载体来比较多聚赖氨酸与鱼精蛋白对靶向性基因转移复合体携带DNA的能力及体外基因转移效率的影响。结果： 在A375细胞中，鱼精蛋白与多聚赖氨酸参与形成的复合体基因导入率都为50%左右。在ABAE细胞中，鱼精蛋白参与形成的复合体基因导入率只有20%左右，而多聚赖氨酸可达70%左右。鱼精蛋白参与形成的复合体导入引起的基因表达在转染后第6天达到高峰，传代培养不影响基因的表达水平；多聚赖氨酸在转染后第7天达到高峰，传代培养使基因的导入率明显下降。结论

2、: 鱼精蛋白在血管内皮生长因子受体介导的基因转移系统中的应用具有一定的限制性。关键词多聚赖氨酸； 鱼精蛋白； 血管内皮生长因子受体； -半乳糖苷酶基因；基因转移中国书资料分类法分类号R73-36The Influence of Polycationic Polypetride on the Transfective Efficacy of Non-Viral VectorLi Junmin, Tian Peikun, Jiang Huiqiu, Gu Jianren(National Laboratory for Oncogenes and Related Genes, Shanghai Ca

3、ncer Institute, Shanghai 200032)AbstractObjective: Purpose to investigate the different in vitro function of targetable non-viral vector containing poly-L-lysine or protamine. Methods： Using GV1 and GV2 targetable non-viral vectors, the influences of the poly-L-lysine and protamine on in vitro gene

4、transfer efficiency and the course of gene expression were observed. Results： -galactosidase was expressed at intermediate level (50%) in A375 cells using a complex containing either protamine or poly-L-lysine. However, in case of ABAE cells, -galactosidase expression level was low (20%) transferred

5、 with a complex containing protamine. On the contrary, -galactosidase expression was at high level (70%) provided that protamine was replaced with poly-L-lysine. In addition, -galactosidase activity reached the peak at the 6th day after transfection with the complex containing protamine. The express

6、ion was not altered with subsequent subcultures, at least for 3 passages. Using poly-L-lysine, the expression peak in A375 reached the peak at the 7th day after transfection, but the level declined along with subsequent passages of cells. Conclusion: The apllication of protamine in VEGF receptor med

7、iated gene delivery system was limited.Key wordsprotamine； poly-L-lysine； VEGF receptor； -galactosidase gene； gene transfer DNA-多聚阳离子-配体形成的复合体可以通过受体介导的内吞作用将目的基因靶向性导入含相应配体的细胞中1。目前，大部分受体介导的靶向性非病毒载体都利用多聚赖氨酸作为骨架分子来包裹DNA形成复合体，并在实验室研究中取得了较好结果，但由于多聚赖氨酸的临床安全性未知，难以应用于临床研究。鱼精蛋白是一种富含精氨酸的小分子量的碱性蛋白，在精子形成过程中，取代体细

8、胞核中的组蛋白，参与精子核DNA的凝集2。鱼精蛋白在临床上用于治疗男性不孕症，并可与血液中的肝素拮抗，具有安全性3。在胰岛素样生长因子受体及表皮生长因子受体介导的靶向性非病毒载体系统中鱼精蛋白不仅可以取代多聚赖氨酸并且比它具有更高的基因转移效率。血管内皮生长因子受体介导的GV1，GV2基因转移系统可将目的基因靶向性的转入含血管内皮生长因子受体的细胞4。但是由于鱼精蛋白是一种血管生长抑制剂，对血管内皮生长因子与其受体的结合有抑制作用5，因此，有必要探求鱼精蛋白应用于该基因转移系统的可行性。1材料与方法1.1细胞及质粒A375人恶性黑色素瘤细胞系：由中国科学院上海细胞生物研究所提供。ABAE(bo

9、vin aortic arch-derived endothelial cell)牛主动脉弓内皮细胞：由上海医科大学放射医学研究所原代培养。pSV2-galactosidase 质粒购自Promega公司。1.2主要试剂参照文献4。1.3配体寡肽-多聚阳离子多肽（LOP-PCP）与内吞小体释放寡肽-多聚阳离子多肽(EROP-PCP)的制备参照文献4。1.4确定共价连接物与DNA的质量数最佳比例0.2 g pSV2-galactosidase质粒DNA与不同质量比的共价连接物(LOP-PCP, EROP-PCP)混合,室温静置30 min，以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA阻滞情况。1.5四元复合物

10、(PCP-GV1/HA20/-gal, PCP-GV2/HA20/-gal)及五元复合物(PCP-GV1/GV2/HA20/-gal)的制备与鉴定参照文献4。1.6复合体介导的-gal基因体外基因转移1.6.1传代培养观察复合体对细胞的基因转移4105细胞接种于2 ml培养液中，5%CO2，37温育24 h后，待细胞达为60%70%时，移去培养液，加入含复合体的新鲜培养液，24 h后移去转染培液，用胰酶消化细胞后，按12，14，18，18接种在2 ml培养液中，5%CO2，37继续培养。1.6.2原代培养观察复合体对细胞的基因转移2105细胞接种于1 ml培养液中，5%CO2，37，培养24

11、h后，待细胞长至满度为4050%时，移去培养液，加入含复合体的新鲜培液，继续培养。1.7细胞染色参照文献4。1.8基因转移效率的计算细胞染色后，在倒置显微镜下，计数3个视野中，被染成蓝色的细胞数与未染成蓝色的细胞数，取其平均数，并计算出染成蓝色细胞数占总细胞数的百分比，即为复合体对细胞的基因转移效率。2结果2.1PCP-LOP及PCP-EROP共价连接物的构建DNA与鱼精蛋白参与形成的共价连接物的最佳配比为15（1A）；而DNA与多聚赖氨酸参与形成的共价连接物的最佳配比为11.5(1B)。1共价连接物的DNA阻滞实验Fig. 1DNA retardation in 1% agarose gel

12、 by conjugatesA: Altered migration of plasmid DNA binded by conjugate GV1/protamine(P-GV1) and GV2/protamine(P-GV2) and HA20/protamine(P-HA20), From 0 to 6, the ratio of DNA to conjugate was 10, 11, 12, 13, 14, 15 and 16. M: /Hind markersB: Altered migration of plasmid DNA binded by conjugate GV1/Po

13、ly-L-lysine (P.L-GV1) and GV2/poly-L-lysine (P.L-GV2), From 0 to 5, the ratio of DNA to conjugate was 10, 10.5, 11, 11.5 and 12. M: /Hind markers2.2基因转移复合体的形成按照共价连接物与DNA的最佳配比包裹好四元复合体与五元复合体，进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察DNA的阻滞，结果如2所示，具有功能的复合体在凝胶上没有DNA的迁移。2.3复合物体外对不同细胞进行基因转移的效率及靶向性2.3.1原代培养观察复合体对受体中度表达的A375细胞的基因转导效率及

14、靶向性以含0.2 g DNA复合体每毫升培养液对A375细胞进行转染，于转染后第6天进行细胞染色，结果如3所示。多聚赖氨酸作为骨架分子的复合体对A375细胞的基因转移效率比鱼精蛋白略高，但是差异并不显著，两者都为50%左右。2四元复合体与五元复幌体的DNA阻滞实验Fig. 2The retardation of DNA in 4-element and 5-elementcomplexes was examined by 1% agarose gel electrophoresisA: DNA retardation of different complexes containing prot

15、amine, From lane 1 to 3, DNA retardation of complex GV1/protamine/HA20/pSV2-gal, GV2/protamine/HA20/pSV2-gal, GV1/GV2/protamine/HA20/pSV2-gal was examined respectively.B: DNA retardation of different complexes containing poly-L-lysine, From lane 1 to 3, DNA retardation of complex GV1/poly-L-lysine/H

16、A20/ pSV2-gal, GV2/poly-L-lysine/HA20/ pSV2-gal, GV1/GV2/poly-L-lysine/HA20/pSV2-gal was examined respectively. M： /Hind markers2.3.2传代培养观察复合体对受体中度表达的A375细胞的基因转导效率及靶向性以含0.2 g DNA复合体每毫升培养液对A375细胞进行转染、传代，于转染后第2至7天分别进行细胞染色，结果如表1所示。鱼精蛋白构建的复合体介导转移基因表达在第6天达到高峰，传代（至少3代）并不影响外源基因在A375细胞中的表达。多聚赖氨酸构建的复合体介导转移基因

17、的表达在第7天达到高峰，但是经传代培养，基因的表达水平就明显下降。2.3.3原代培养观察复合体对受体高度表达的ABAE细胞的基因转导效率及靶向性以含0.2 g DNA复合体每毫升培养液对ABAE细胞进行转染，于转染后第6天，进行细胞染色。多聚赖氨酸构建的复合体介导的基因转导效率大约为70%（4），而鱼精蛋白只有20%左右（结果未示）。2.3.4传代培养观察复合体对受体高度表达的ABAE细胞的基因转导效率及靶向性6105细胞接种于25 ml培养瓶中，细胞满度达60% 时按0.2 g DNA的复合体每毫升培养液对ABAE细胞进行转染，培养24 h后，按12, 14, 14传代，于转染后第4，6，7

18、天分别对细胞进行固定、染色，结果如表2所示。鱼精蛋白构建的复合体的导入率只有20%左右；而poly-L-lysine构建的复合体的导入率可达50%左右。3不同基因转移系统转染A375细胞的基因表达Fig. 3Expression of -galactosidase gene in A375 cellstransfected with different gene delivery systemA: A375 cells transfected with complex GV1/poly-L-lysine/HA20/-gal(P.L-GV1,400) and GV2/poly-L-lysine/

19、HA20/-gal (P.L-GV2, 400); B: A375 cells transfected with PBS (a 400)， complex GV2/protamine/HA20/-gal (b 400)， GV1/protamine/HA20/-gal (c 400)and GV1/GV2/protamine/HA20/-gal (d 400)3讨论在以多聚赖氨酸为骨架的复合体中，多聚赖氨酸与DNA包裹比较紧密6，有利于复合体与细胞表面的受体的相互作用，有助于复合体进入细胞，导致复合体的基因导入效率比较高；而鱼精蛋白与DNA结合较疏松，导致参与形成的复合体的基因导入效率相对于略

20、低。表1不同基因转移系统转染A375细胞传代后的基因表达Tab. 1-gal gene expression level in cultured A375 cell mediated with various complexesDays(d)VectorThe first generationSecond Third234567465GV1/protamine/HA20/-gal+/+GV1/poly-L-lysine/HA20/-galND+/+NDGV2/protamine/HA20/-gal+/+/+NDNDNDGV2/poly-L-lysine/HA20/-galND+/+DNDNDN

21、DGV1/GV2/protamine/HA20/-gal+ND+/+NDNDNDGV1/GV2/poly-L-lysine/HA20/-galNDNDND+/+DNDControl-Note: - negative； no expression； + indicated low expression level； +/+ indicated relatively low expression level； + indicated relatively high expression level； ND: not detected; D: cell died. 4多聚赖氨酸参与形成的基因转移复合

22、体转染ABAE细胞的基因表达效率Fig. 4Expression of -galactosidase gene in ABAE cells trans-fected with different gene delivery system containing poly-L-lysineABAE cells transfected with complex GV1/poly-L-lysine/HA20/-gal (P.L-GV1 40), GV2/poly-L-lysine/HA20/-gal (P.L-GV2 40) and GV1/GV2/poly-L-lysine/HA20/-gal (P

23、.L-GV1/GV2 40)表2不同基因转移系统转染ABAE细胞传代后的基因表达不同时间的-半乳糖苷酶基因的表达水平Tab. 2-gal gene expression level of cultured ABAE cells mediated with different complexesDays(d)VectorThe first generation467GV1/protamine/HA20/-gal+/+GV2/protamine/HA20/-gal+/+GV1/GV2/protamine/HA20/-gal+/+GV1/poly-L-lysine/HA20/-gal+GV2/pol

24、y-L-lysine/HA20/-gal+/+GV1/GV2/poly-L-lysine/HA20/-gal+/+/+Control-/+Note: -/+ indicated only few cells expressed -gal； + indicated low expression level； +/+ indicated comparative low expression level； + indicated intermediate expression level但是，鱼精蛋白是一个碱性蛋白，与DNA的结合比较疏松，进入细胞后，可能易解离，使质粒DNA游离出来，进行复制与表达

25、；鱼精蛋白是一种核蛋白，具有核定位信号，有利于携带DNA穿过核孔复合体进入核内；鱼精蛋白又是一种DNA结合蛋白，在精子形成过程中，取代体细胞核中的组蛋白参与核小体的形成。这些特性可能有利于促使DNA随机整合入染色体，有利于导入基因的长时间表达。本实验中，鱼精蛋白参与形成的复合体转染A375细胞后，至少三代的传代培养不导致基因表达效率的降低，暗示了基因的整合。若鱼精蛋白参与形成的复合体的这一特性被直接证明，可以改变非病毒载体不可整合，只可瞬时表达的缺陷7。同时，鱼精蛋白是一种血管抑制剂，体外可以抑制血管内皮细胞的生长，体内可以通过影响肝素与VEGF的结合，抑制VEGF与血管内皮细胞上的VEGF受

26、体的结合来抑制血管的生长，从而抑制肿瘤的生长8。总而言之，鱼精蛋白形成的复合体比多聚赖氨酸参与形成的复合体转导外源基因后，基因的表达时间要早，持续时间要久。细胞可传代培养而不发生质粒的丢失；但是基因转移效率较低。但在体内导入实验中，皮下接种肿瘤动物模型的肿瘤细胞与肿瘤血管内皮细胞中的-gal基因表达水平相似4，可能是由于内源的肝素抵消了鱼精蛋白引起的抑制作用。因此，鱼精蛋白在VEGF受体介导的基因转移系统的限制性还需进一步摸索。致谢感谢上海医科大学放射医学研究所的盛民立教授与姜雅梅老师提供牛主动脉弓内皮细胞（ABAE）。 李钧敏（上海市肿瘤研究所癌基因与相关基因国家重点实验室上海200032）

27、田培坤（上海市肿瘤研究所癌基因与相关基因国家重点实验室上海200032）蒋惠秋（上海市肿瘤研究所癌基因与相关基因国家重点实验室上海200032）顾健人（上海市肿瘤研究所癌基因与相关基因国家重点实验室上海200032）参 考 文 献1，Fritz JD, Herweijer H, Zhang GG, et al. Gene transfer into mammalian cells using histone-condensed plasmid DNA, Hum Gene Ther, 1996, 7: 13952，Bianchi F, Rousseaux-prevost R, Bailly C， et al. Interaction of human P1 and P2 protamine with DNA. Biochem Biophys Res Commun, 1994, 201(3): 11973，Vzina D, Sh