重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达

1、实验报告题目:单元三:重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达指导老师:邓庆丽日期:2013/10/31-201311/1一.实验目的：(1) 了解和掌握IPTG诱导表达的原理和操作方法。(2) 了解降解物阻遏的现象及其机理。二实验原理：本实验使用的是载体是已重组好的pGFPuv ,宿主细胞为大肠杆菌，目的基因的产物为融合蛋白，目的蛋白为绿色荧光蛋白 GFP非目的蛋白即融合部分为标签6X His，用于单元四的亲和层析分析。本实验采用的启动子为可调控的强启动子乳糖操纵子lac。操纵子是原核基因表达的协调单位。通常由2个以上功能相关的结构基因以及一些调节序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。乳糖操纵子由三

2、个结构基因Z、Y、A和操纵序列、启动子、CAP结合位点等调节序列组成，如下图 1所示：启动子祖逼基因终止子CAP齬骨位点启动子燥纵寿列结构基因 -P"*P"賦6£A卩-半乳糖苛酶"透性甜A：乙酰基转移酶"图I.乳糖操纵子的结构示意图”乳糖操纵子的调节包括诱导效应和降解物阻遏效应。（1）诱导表达当没有乳糖存在时，调节基因lacI表达，转录的 mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与操纵序列lacO结合，阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动，使目的基因（本实验中的绿色荧光蛋白基因 GFP不能转录，也就不能翻译出蛋白质。也就是说，当没有乳糖 存在时

3、，乳糖操纵子处于阻碍状态，如下图2所示：阻遏蛋白图2-乳糖換纵于的调节机制"当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的构象发生改变，而不能结合到操纵序列上，RNA聚合酶可以从启动子向3'端移动，于是，结构基因可以转录出mRNA，然后翻译出蛋白质。也就是说，当有乳糖存在时，乳糖操纵子被诱导，如下图 3所示：启动子阻遏基因终止子CAP结合也点已动子操纵序列目的基因p.lacj)*poliuRNA ”启动转录”异乳糖""I-半乳糖昔龍”乳糖.图3.乳糖操纵子的调节机制”乳糖操纵子的诱导物是异乳糖。IPTG是异乳糖的结构类似物。

4、由于IPTG不会被分解， 它的诱导作用是持久的。(2)葡萄糖降解物的阻遏作用代谢物基因激活蛋白(Catabolite gene Activation Protein)CAP，又称cAMP受体蛋白属 于激活蛋白的一种，对乳糖操纵子进行正调节。CAP分子内分别有 DNA结合区和cAMP结合区。当CAP与cAMP结合后，就可结合 DNA促进乳糖操纵子的转录。葡萄糖降解物能抑制腺苷酸环化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，从而降低cAMP的浓度，抑制乳糖操纵子的转录。本实验使用的表达载体 pGFPuv上含有乳糖操纵子的调节序列， 目的基因表达的是带 6 X His的重组绿色荧光蛋白。在 IPTG的诱导下

5、，融合蛋白表达可增强 105倍，并且可用金 属螯合亲和层析分离纯化，最终获得纯的重组绿色荧光蛋白。三.材料与试剂：材料工程菌：BL21(DE3)p32a、BL21(DE3)pGFPuv试剂LB 液体培养基 ：蛋白胨(tryptone) 10g、酵母粉(yeast extract) 5g、NaCl 10g，加 800mL双蒸水溶解，用 10M NaOH调pH至7.2-7.5，定容至1000mL。分装，高压灭菌，4C保存。氨苄青霉素溶液：无菌双蒸水配成100mg/mL，分装，-20C保存，使用终浓度为50卩g/mL 或 100 卩 g/mL。IPTG溶液(100 mM ):将238.3mg IPT

6、G溶解于10mL双蒸水，0.22卩m细菌滤器过滤 除菌，分装，-20 C保存备用，贮存浓度为100 mM。20%葡萄糖溶液阻遏蛋白超声平衡缓冲液：50mM Tris-HCl, 500mM NaCl pH7.0四实验仪器：超净工作台、 低温摇床、高速冷冻离心机、超声破碎仪等。 五实验步骤、现象、结果及分析：1工程菌的活化（10月30号教师准备）分别挑取工程菌 BL21（DE3）p32a 和BL21（DE3）pGFPuv 的单菌落 接种到5mlLB液体培养基（含氨苄，终浓度为100卩g/mL，以下同）晚上7点接种37 C、250rpm培养14h过夜至对数生长期第二天早上9点 左右取出放入4 C备用

7、2放大（10月31号）往装于500ml三角瓶中的170ml LB液体培养基中加入 170卩L Amp，摇匀，取三支灭 菌试管，用5ml枪各加入5ml LB液体培养基（含氨苄），分别编号为1#, 2#, 3#,剩下的 装于三角瓶中的液体培养基（含氨苄），编号6#,全部按1: 50的比例接种菌种，操作如下：1#接种100卩LBL21(DE3)p32a2#接种 100卩L BL21(DE3)pGFPuv3#接种 100卩LBL21(DE3)pGFPuv6#接种3mLBL21(DE3) pGFPuv下午接种于37C、250rpm培养约2h，顺便配制单兀四蛋白质纯化及电泳所需试剂。3.诱导1#、2#不需

8、处理3#加入20%葡萄糖 250卩L , 至终浓度为1.0% ;加入25卩L100mM IPTG 至终浓度为0.5mM。6#加入100mM IPTG 约750卩L至终 浓度为0.5mM。于25 C、250rpm培养过夜4收菌（注意米集标本并编号）（11月1号早上9点开始）从6#三角瓶培养的150mL菌液中取出5mL置于一支试管中（编号为 4#）。（1）分别从2 # , 3#, 4#培养物各取100卩L于EP管 用于电泳。（相应编号为S2,S3,S4）。将1#, 2 # , 3#, 4#试管中的菌液分别收集到 4 个1.5mLEp离心管中（收3 次）,编上相应编号。1#,2 # , 3#离心弃上

9、清（10000rpm离心1min） ;4#第三次离心后上清液收集到另一个Ep管，编号为5#。6#三角瓶中剩余菌液用两管50mL离心管于 8000rpm, 4C,离 心5min，弃上清收集菌体。5观察及超声破碎于紫外灯下观察1# -5#管收集的菌体或上清 液，观察哪支管有荧光(荧光强弱) ，记录观察 到的现象，并拍照。结果如下图一所示：图一：1# -5#管紫外观察结果，从左到右依 次为1# -5#管。(1) 全部菌体用50ml超声平衡缓冲液重 悬(50mmol/L Tris-HCI，500mmol/LNaCI pH7.0)，即每管用25ml超声缓冲 液重悬，用枪吹散，后倒入 50ml烧杯 中，置

10、于装满碎冰的1L烧杯中，使小烧杯高出大烧杯1cm左右，便于超破时 观察菌液液面。(2) 超声波破菌，破碎之前测得OD0。为0.381，三周期后测得 O臥为0.134， 然后用50ml离心管收集并于8000rpm , 4C,离心10min，取上清(弃沉淀)， 保存于-20C冰箱，下周层析实验备用。六.思考与讨论(1) 对紫外灯下观察到的结果作出解释。答：图一中从左到右依次为1# -5#管，可以看出4#管绿色荧光最强，2#次之，其余1#、3#、5#均无颜色。原因是1#管中质粒为非重组质粒 p32a,不含GFP，因而无法表达产生绿 色荧光蛋白，为阴性对照；2#管-4#管中大肠杆菌均含重组质粒pGFP

11、uv, 2#管中未经诱导，绿色荧光蛋白为本底水平的表达，因而显示出淡淡的绿色荧光；4#管中经过IPTG的诱导表达，GFP产量很高，因而显示出很深的绿色荧光；而3#管虽然加入了 IPTG进行诱导表达，但是还加入了浓度为 1%的葡萄糖，导致CAMP 浓度降低，从而抑制了乳糖操纵子上游的激活位点， 抑制了乳糖操纵子的转录， 因而无法产 生绿色荧光；5#管为4#管最后一次离心的上清液，因菌体未破碎，因而上清液中不含GFP，因而也就无法产生绿色荧光。(2) 为什么诱导表达的大肠杆菌要在其OD0。浓度约为0.5时加入IPTG?答：大肠杆菌要在其 ODoo浓度约为0.5时基本进入对数生长期，菌体生长旺盛，增殖 快，对诱导表达而言，会有一个比较好的收率。若浓度较低时，菌体吸收的营养都用于表达 外源蛋白，势必会严重影响它的繁殖，菌体量少了，总的外源蛋白表达量也会变少，当在