肺炎衣原体抗体的制备及应用

1、肺炎衣原体抗体的制备及应用              作者：王卫群 张瑞华 余竹元【摘要】  目的  肺炎衣原体抗体(Cpn-PcAb)的制备及应用。方法  用10l Cpn菌株TW-183(2×108ifu)与300l福氏完全佐剂混匀后皮下多点注射新西兰白兔。双向琼脂扩散法鉴定血清抗体的效价为164，用硫酸铵盐析法、DEAE-Sephadex-50层析法纯化免疫球蛋白(IgG)，然后用异硫氰酸荧光素(FITG)标记IgG。用

2、Cpn-PcAb与美国进口Cpn-单抗(Cpn-McAb)同时检测病人外周血标本294例。另外，分别从Cpn-PcAb检测出Cpn特异性抗原阳性的外周血单核细胞(PBMC)标本(A组)中和对照组(B组)中随机各挑选20例，用PCR检测PBMC中的Cpn-DNA。结果  Cpn-PcAb检测的阳性率为45.9%(135/294)，Cpn-McAb检测的阳性率为43.5%(128/294)，两种抗体同时阳性的标本有110例，Kappa值是07，根据其判断标准提示两者有较高的一致性。A、B两组Cpn-DNA阳性标本分别为17例和3例。结论  Cpn抗体几乎和Cpn单抗一样有较高的

3、特异性和敏感性，可能可以替代进口单抗用于临床Cpn感染的检测，有助于相关疾病的诊治。        【关键词】  肺炎衣原体多克隆抗体  肺炎衣原体单克隆抗体  微量免疫荧光  外周血单核细胞        Production and application of polyclonal antibody to chlamydia pneumoniae       &

4、#160;       【Abstract】  Objective  Production and application of polyclonal antibody to chlamydia pneumoniae (Cpn).Methods  The New Zealand white rabbit was subcutaneously injected with 10l Cpn strain TW-183(2×108ifu) and 300l complete Freund adjuvan

5、t.The serum antibody titer of 164 was identified by two dimensional immunodiffusion test.IgG was extracted from serum and purified by ammonium sulphate salting out and DEAE-Sephadex A-50 chromatography，then was labeled by fluorescein isothiacyanate.In order to evalute Cpn-PcAb，the blood specimens of

6、 294 patients were deected by Cpn-PcAb and Cpn monoclonal antibody (Cpn-PcAb) from USA at the same time.On the other hand，we randomly selected 20 peripheral blood mononuclear cell (PBMC) specimens with Cpn antigen positive (group A) and 20 ones with Cpn antigen negative (group B) by Cpn-PcAb detecti

7、on，then detected Cpn-DNA in PBMC by PCR.Results  The positive rate was 45.9% (135/294) for Cpn-PcAb and 43.5%(128/294) for Cpn-McAb，and 110 cases have the same positive for them，showing the high concordance between them (Kappa=0.7).The specimens of positive Cpn-DNA were in 17 and 3 respectively

8、 between group A and group B.Conclusion  The Cpn-PcAb has almost the same high specificity and sensitivity as Cpn-McAb.The Cpn-PcAb may be replace Cpn-McAb to detect the Cpn specific antigen and be helpful to diagnose and treat the clinical diseases associated with Cpn infection.  

9、60;     【Key words】  polyclonal antibody to chlamydia pneumoniae (Cpn-PcAb)  monoclonal antibody to Cpn(Cpn-McAb)  micro-immunofluorescence  peripheral blood mononuclear cell        肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae，Cpn)是嗜衣原体(Chlamydohila pne

10、umoniae)属下的一个种，是一种常见的呼吸道病原体，带菌者和隐性感染者非常普遍，。近年来在多种系统疾病患者血清中检出的Cpn-抗体均显著高于相应对照组3，如心血管系统、呼吸系统、血液系统疾病等，因此Cpn已成为危害人类健康的一种病原体，尤其是它在动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)形成过程中的作用日益受到国内外学者广泛关注。Cpn感染和AS之间的关系已为血清流行病学、病理学和分子生物学等实验技术所证实4。笔者亦建立了外周血单个核细胞中Cpn-抗原的检测方法5，并用于临床检测，为临床相关疾病的诊治提供可靠依据。但是，目前检测Cpn-抗原所用的单抗主要依赖进口，为此笔者尝试用家

11、兔自制抗Cpn抗体，并已获得成功，现将结果报道如下。        1  材料与方法        1.1  兔抗肺炎衣原体抗体的制备  用10l Cpn菌株TW-183(2×108ifu)与300l福氏完全佐剂混匀后皮下多点注射新西兰白兔(New Zealand white，NZW)，在第14、28和42天，用10l Cpn菌株与300l福氏不完全佐剂混匀后皮下多点注射NZW，用双向琼脂扩散法鉴定其抗血清效价(164)后，颈动脉插管放

12、血55ml，分离出血清25ml，用硫酸铵盐析法、DEAE-Sephadex-50层析法逐步纯化兔免疫球蛋白(IgG)，用考马氏亮蓝法测其蛋白含量为3.45mg/ml。        1.21.3  Cpn-PcAb与Cpn-McAb同时检测标本  复旦大学附属金山医院住院患者共294例，其中冠心病、高血压、心肌梗死、糖尿病等患者109例，肺炎、支气管炎、哮喘、肺气肿等患者135例，慢性鼻炎、鼻息肉、鼻窦炎、咽喉炎、扁桃体炎等患者50例。常规无菌采集静脉血3ml，EDTA抗凝。外周血单核细胞(PBMC)分离参照Moa

13、zed等6方法略加修改：抗凝血2000rpm离心5min，吸出血浆后的余血用等体积PBS稀释混匀，再缓慢加到含有3ml淋巴细胞分离液试管中，然后于室温2200rpm离心30min，吸出含有PBMC的中间云雾状层，用PBS洗至不含红细胞后，悬浮于PBS中，使其约含PBMC 5×106个。PBMC中Cpn-抗原的检测参照Timms等7方法略加改进：吸取新鲜制备的PBMC悬浮液10l(约含PBMC 6×105个)分别在载玻片上涂出2个直径45mm的圆点，电吹风吹干后丙酮固定3次。其中一个圆点作为空白对照，另一个圆点加上5l Cpn-McAb(FITC-TT-401)稀释液(工作浓

14、度140，即5l FITC-TT-401原液+195l 0.01%伊文氏蓝PBS)，置湿盒于37温育1h，PBS洗3次，每次3min，再用蒸馏水洗3次，电吹风吹干。同时用自制FITC-Cpn-PcAb进行平行操作。然后将载玻片置荧光显微镜下(HB0200汞灯，第一滤片：BG-12，第二滤片：CG-13和WILD8075)由2人观察并核对大小均匀的特征性苹果绿亮点。测定圆点内的荧光亮点数减去空白圆点内的荧光亮点数后的差数，作为特异性抗原阳性的依据。阳性对照：Cpn菌株(TW-185)牛奶稀释液作为抗原，以PBS为阴性对照。抗原阳性判断标准参照Muhlestain等8的标准：强阳性(100个亮点/

15、原点)，阳性(10100个亮点/原点)，阴性(10个亮点/原点)。        1.4  PCR法检测外周血单核细胞中Cpn-DNA  按笔者已发表的方法进行9。1.5%凝胶于5V/cm下电泳1h，在紫外灯下观察结果，PCR扩增产物为474bp。        1.5  统计学处理          采用2检测法  P0.05为差异有显著性。          采用Kappa值判断两种方法的一致性强度  Kappa值在0.610.80，一致性强度属于高度。        2  结果        2.1  Cpn抗体效价和交叉反应鉴定  应用进口可溶性Cp