川崎病患儿冠状动脉病变的发生机理及其预防探讨

1、王宏伟程佩萱陈绍军鲁维伟 本文获第二次全国中青年儿科医学学术交流会优秀论文一等奖 作者单位：430030，武汉，同济医科大学附属同济医院儿科 【摘要】目的观察川崎病患儿冠状动脉病变的发生机理及丙种球蛋白对其防治作用。方法应用细胞培养、免疫细胞化学染色、核酸杂交和流式细胞分析方法。结果川崎病患儿血清能够强烈诱导人血管内皮细胞表达血小板源生长因子(PDGF)B链蛋白；经川崎病血清作用后的内皮细胞条件培养基(ECM)亦能显著促进血管平滑肌细胞表达PDGF受体mRNA，并强烈诱导平滑肌细胞增殖。丙种球蛋白则能显著抑制川崎病血清的上述诱导作用。结论PDGF-PDGF受体途径激活参与了川崎病冠状动脉病变的

2、形成；丙种球蛋白的防治作用与抑制PDGF-PDGF受体途径的激活有关。 【关键词】粘膜皮肤淋巴结综合征丙种球蛋白类冠状动脉疾病受体，血小板源生长因子 Pathogenesis of coronary artery lesion in Kawasaki disease and its preventionWang Hongwei, Cheng Peixuan, Chen Shaojun, et al. Department of Pediatrics, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030 【Abstract】Objec

3、tiveTo investigate pathogenesis of coronary artery lesion in children with Kawasaki disease and to evaluate the preventive effectiveness of r-globulin on the lesion. MethodsThe methods of cell culture, immunocytochemistry,hybridization and flow cytometry were used in this study. ResultsSerum from pa

4、tients with Kawasaki disease strongly induced the expression of PDGF B chain protein; the expression of PDGF receptor mRNA was significantly promoted; and the proliferation of vascular smooth muscle cell was induced by the endothelial call conditioned media. However, the above effects of the serum f

5、rom cases of Kawasaki disease were markedly inhibited by r-globulin. ConclusionActivation of PDGF-PDGF receptor may play a role in the pathogenesis of coronary complication of kawasaki disease; the preventive effects of -globulin relate to the inhibition of activated PDGF-PDGF receptor. 【Key words】M

6、ucocutaneous lymph node sgndromGamma-globulinsCoronary diseaseReceptors, platelet-derived growth factor 研究观察川崎病患儿血清对体外培养血管内皮细胞表达血小板源生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)B链蛋白的影响，以及川崎病血清作用后的内皮细胞条件培养基(endothelial cell conditioned media, ECM)对血管平滑肌细胞表达PDGF受体mRNA和平滑肌细胞增殖的影响，并观察丙种球蛋白对上述过程的作用。探讨川崎病冠状动

7、脉病变发生机理和丙种球蛋白防治作用的机理。 对象和方法 一、主要试剂 PDGF-B链蛋白单克隆抗体由日本Mochida制药有限公司Sugihara博士惠赠。LSAB法免疫细胞化学试剂盒为Zymed公司生产。PDGF受体亚型核酸探针(cDNA，4.7 kb)Oncogene公司生产。丙种球蛋白为成都生物制品研究所产品。 二、方法 1.川崎病患儿血清制备：取3例住本院的川崎病急性期(发热10天内)患儿和3例本院门诊健康体检的正常儿童静脉血，每例4 ml，常规方法分离血清冻存。实验前将血清溶化，分组合并，微孔滤器除菌。 2.人脐静脉内皮细胞培养和实验分组：取本院妇产科产房健康产妇分娩后4小时内健康新

8、生儿脐带行内皮细胞原代培养1。分三组：(1)正常血清组：M199+10%小牛血清+10%正常血清；(2)川崎病血清组，M199+10%小牛血清+10%川崎病患儿血清；(3)丙种球蛋白组，同川崎病血清组，另加入丙种球蛋白，终浓度为4 mg/ml。并按文献2方法制备ECM。 3.兔主动脉平滑肌细胞培养：按文献方法取4周龄日本大耳白兔主动脉中膜平滑肌细胞行原代和传代培养2。第4代平滑肌细胞生长达亚融合时弃去原培养基，分别加入上述各组的ECM，即分为三组：正常血清-ECM组，川崎病血清-ECM组和丙种球蛋白-ECM组。继续培养10小时后收集标本。 4.免疫细胞化学染色：采用LSAB法，按试剂盒操作说明

9、书进行。PDGF-B链蛋白单克隆抗体工作浓度为1500。用TJTV-300型图像分析仪测定PDGF-B链蛋白在各组中的表达强度。 5.Northern印迹杂交和狭缝杂交：按分子克隆实验指南介绍的方法提取各组平滑肌细胞的总RNA，随机引物法标记PDGF受体亚型核酸探针，进行Northern印迹杂交和狭缝杂交3。狭缝杂交强度用图像分析仪处理。 6.流式细胞仪测定血管平滑肌细胞周期：采用EPICS-751型流式细胞仪，按文献介绍的方法测定各组平滑肌细胞的细胞周期构成，了解其增殖分化状况4。每组标本每次计数10 000个细胞，重复6次，以细胞周期中各细胞的多少计算结果。 三、统计学方法 各组数据以s表

10、示。组间比较采用t检验。 图1正常血清组，PDGF-B阳性表达信号呈棕黄色，位于核周胞浆。LSAB250 图2川崎病血清组，PDGF-B表达明显增强，弥漫于胞浆及胞核。LSAB250 图3丙种球蛋白组，PDGF-B表达强度与川崎病血清组比较明显减弱。LSAB250 图4血小板源生长因子受体亚型在血管平源肌细胞中的表达C-正常血清组，K-川崎病血清组，G-丙种球蛋白组左图为Northern印迹杂交结果，右图为狭缝杂交结果 结果 一、免疫细胞化学染色 与正常血清组比较，川崎病血清组PDGF-B链蛋白表达强度明显增加(P0.01)；而丙种球蛋白组与川崎病血清组比较，PDGF-B链蛋白的表达强度则明显减弱(P0.01)(表1，图13)。 二、Northern印迹杂交和狭缝杂交 Northern杂交结果显示，各组平滑肌细胞均有PDGF受体亚型mRNA的强烈表达，mRNA分子约为4.7kb。川崎病血清-ECM组与正常血清-ECM组