低浓度α生育酚对神经元细胞膜的保护作用

1、低浓度生育酚对神经元细胞膜的保护作用 07-08-17 10:03:00 编辑：studa20 作者：梁伟伦 黄慧玲 武俏丽 王辰 张文治 苏心 只达石 【摘要】 目的: 探讨低浓度生育酚对神经元细胞膜的保护作用. 方法: 培养SD胎鼠皮层神经元细胞作为实验对象. 将神经元细胞进行分组：正常对照组、氧自由基损伤组和不同浓度生育酚处理组(10，20，40和80 mg/L). 用Fenton反应对神经元细胞膜造成损伤. 在损伤后1及2 h分别对各组神经元进行PI染色，利用激光共聚焦显微镜观察神经元细胞膜的损伤情况，并用TBA法检测神经元细胞外液中丙二醛(MDA)生成量. 结果: 80 mg/L浓度

2、生育酚可减少氧自由基对神经元细胞膜的损伤, 且可减少MDA生成量. 结论: 80 mg/L浓度生育酚可以有效对抗氧自由基对神经元细胞膜的损伤. 【关键词】 生育酚 神经元 细胞膜 低浓度 0引言 氧自由基是引起颅脑损伤等多种中枢神经疾病继发损伤的重要因素. 而维生素E是一种天然的抗氧自由基物质. 维生素E共包括8种分子，其中生育酚为公认抗氧自由基最有效的1. 在近年的研究中，已证实生育酚可阻止氧自由基对细胞膜中多不饱和脂肪酸及膜蛋白的攻击，防止细胞膜功能的丧失2. 然而国内外学者对应用多大浓度的生育酚才可有效保护细胞膜有很大分歧. 本实验我们利用Fenton反应形成氧自由基对胚胎大鼠皮层神经元

3、的损伤，观察低浓度生育酚对神经元细胞膜的保护作用. 1材料和方法 1.1材料生育酚、碘化吡啶（PI）染料（Sigma公司，美国）；2.5 g/L胰蛋白酶、0.2 mol/L EDTA、各种细胞培养液（GibcoBRL公司，美国）；MDA检测盒，购于南京建成生物公司；300 mL/L双氧水，硫酸亚铁，维生素C和无水乙醇，均为国产分析纯. 孕14 d的SD大鼠2只，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心. TE200E型激光共聚焦显微镜观察( NIKON公司, 日本)；TG150型二氧化碳培养箱(Jouan公司,法国)；CR22G型离心机（日立公司，日本）；UV240型紫外分光光度计（岛津公

4、司，日本）. 1.2方法 1.2.1生育酚水溶液配制取生育酚10 mg溶于1 mL无水乙醇中，将无水乙醇缓慢滴入49 mL 30去离子水中，制成200 mg/L 生育酚水溶液母液备用. 碘化吡啶染料配制：将碘化吡啶粉末以去离子水溶解为终浓度为1 mg/L工作液. 1.2.2SD大鼠皮层神经元分离及培养将实验大鼠断颈处死，取胚胎脑皮层组织，剪碎，用2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 mmol/L EDTA，令其分散成单细胞悬液，过200目不锈钢网,于37, 50 mL/L CO2培养箱中进行培养. 隔日换液. 培养到第4日，细胞悬液于离心机中以1000 r/min速度离心10 min，去沉淀细胞，加

5、入神经元培养液，接种于涂有鼠尾胶原的25 cm25 cm细胞培养瓶中，使干细胞转化为神经元，隔天换药一次，第6日使用. 1.2.3实验分组将所有神经元培养瓶进行分组，共分为：正常对照组；氧自由基损伤组；不同浓度生育酚处理组（10, 20, 40和80 mg/L亚组，与神经元作用1 h后备用）. 1.2.4利用Fenton反应造成神经元氧自由基损伤按照Yamazaki等3方法，在培养皿中加入硫酸亚铁、维生素C和300 mL/L双氧水，使溶液中硫酸亚铁终浓度为0.2 mmol/L,维生素C终浓度为0.2 mmol/L，双氧水终浓度为0.4 mmol/L，制作氧自由基损伤模型. 1.2.5PI染色按

6、照袁兰等4方法，将PI粉末以去离子水溶解为终浓度1 mg/L工作液. 将氧自由基损伤组及生育酚处理组及正常组培养瓶中加入试剂后，立即开始计时，并取反应开始后1和2 h培养瓶中的神经元进行PI染色，将PI工作液100 L均匀滴在神经元细胞上，置于暗室中染色15 min，用pH 7.0 PBS液冲洗3遍. 1.2.6激光共聚焦显微镜观察细胞形态激光共聚焦显微镜荧光激发波长为567 nm，发射光波长大于590 nm，伪彩色采用红色，在保证信噪比的情况下尽量增大检测的pinhole和PMT. 选定5个图像清晰的视野，在200倍镜下观察. 细胞红染者为细胞膜损伤细胞，未染色者为正常细胞4. 每个视野随机

7、计数100个神经元，记录其中有细胞膜损伤的神经元数，共记录5个视野内神经元，计算平均值. 1.2.7MDA测定采用MDA检测盒，结合紫外分光光度计，按照TBA法分别检测各组神经元培养瓶中溶液的MDA浓度. 每一次取0.1 mL溶液检测，每瓶测值为该瓶溶液的MDA浓度. 统计学处理：所有数据以xs表示，多个样本间均数比较用方差分析，用StudentNewmanKeuls(SNK)法进行多组间两两比较. P0.05认为差异有统计学意义. 2结果 2.1神经元细胞膜损伤分析正常对照组只有极少荧光染色阳性细胞，而损伤组和生育酚处理组均有荧光染色阳性细胞（图1,2）. 生育酚浓度为正常生理浓度10 mg/L时，不能有效消除Fenton反应所造成的氧自由基损伤. 而当生育酚达到8