胃泌素及其受体拮抗剂对原代培养胃癌细胞 的作用研究

1、胃泌素及其受体拮抗剂对原代培养胃癌细胞 的作用研究        【摘要】     目的 研究胃泌素及其受体拮抗剂对原代培养胃癌细胞的作用，探讨胃癌患者非细胞毒内分泌治疗的可行性。方法 从新鲜胃癌切除标本中分离胃癌细胞进行体外培养，应用MTT比色分析法和流式细胞仪观察胃泌素及其受体拮抗剂丙谷胺对细胞增殖、周期分布的影响。结果 胃泌素可明显促进部分胃癌细胞的增殖，使细胞从G0/G1期向S期和G2/M期转化，与对照组比较有显著差异（P<0.01），丙谷胺可阻断胃泌

2、素的作用。对胃泌素敏感的胃癌原发部位多在胃体部（13/34）和贲门部（15/34），胃窦部较少（6/34）；以低分化或未分化腺癌为主（77.1%），多为中晚期。结论 胃泌素可促进部分胃癌患者肿瘤细胞的增殖和细胞内DNA合成，以胃体、贲门癌为著，胃泌素受体拮抗剂可望成为胃癌非细胞毒内分泌治疗新途径。     【关键词】  胃泌素 受体拮抗剂 胃癌 原代培养        胃泌素在胃肠道肿瘤发生、发展中的作用近来引起关注，研究表明MKN45、HCT116等多种胃肠肿瘤细胞中存在胃

3、泌素受体，外源性胃泌素可促进体外培养的上述细胞的增殖和DNA合成1,2，但胃泌素对原代培养胃癌细胞的作用未见报道。为进一步探讨胃泌素对胃癌细胞的作用，我们从54例新鲜胃癌标本中分离出胃癌细胞进行培养，观察外源性胃泌素及其受体拮抗剂对细胞活性及周期分布的影响，现报告如下：    1  资料与方法    1.1  资料    胃癌切除标本57例，经病理证实为胃腺癌，取细胞分离、鉴定满意的54例进入实验。男性31例，女性23例，平均年龄58.4岁。    5肽胃

4、泌素由上海丽珠东风生物技术公司提供，丙谷胺（分析纯）由江苏金坛制药厂提供，淋巴细胞分离液为上海试剂一厂产品，型胶原酶、四唑蓝、十二烷基硫酸钠均为Sigma产品（购自华美生物工程公司）。    1.2  细胞分离、鉴定和培养    术中无菌切取12cm3大小的新鲜肿瘤组织，在超净台上去除脂肪和坏死组织，洗净后剪成1mm3大小的组织糜。参照Yamaue等3方法分离细胞，获单细胞悬液，经HE染色证实为癌细胞，要求纯度在80%以上；经台盼蓝染色，活细胞数在85%以上。    1.3  药物配制

5、和实验分组    胃泌素液：用含0.5%小牛血清的1640培养液将胃泌素浓度配制为25g/ml，丙谷胺液：同上法将丙谷胺浓度配制为32g/ml；实验分组：空白对照组、胃泌素组、丙谷胺组、胃泌素加丙谷胺组和本底对照组。    1.4  MTT比色分析法    上述单细胞悬液用PBS洗涤两次后，用含10%小牛血清的1640培养液调整细胞浓度为1×105/ml，接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液100l，本底对照组加1640培养液100l，每组设8个复孔，培养2448h，在倒置显微镜下观察细

6、胞呈贴壁生长后，弃去培养液。空白对照组及本底对照组加含0.5%小牛血清的1640培养液100l；胃泌素组加胃泌素液100l；丙谷胺组加丙谷胺液100l；胃泌素加丙谷胺组二者各加50l，培养72h，在结束培养前6h加MTT（5mg/ml ）20l/孔，继续培养6h，离心，弃上清，每孔加十二烷基硫酸钠（SDS，20%）100l，震荡5min，置室温半小时后，在酶联免疫测定仪上测定570nm波长处的吸光度值（OD570）。    1.5  细胞增殖率由下列公式计算    增殖率(%)实验组OD570对照组OD570对照组OD570

7、本底组OD570×100    1.6  细胞周期分析    取上述单细胞悬液，调整细胞浓度为1×105/ml，接种于24孔培养板，每孔300l，分组同1.3，每组设4个复孔，培养2448h，待细胞贴壁后弃去培养基，空白对照组加含0.5小牛血清的培养液300l，胃泌素组加胃泌素液300l，丙谷胺组加丙谷胺液300l，胃泌素加丙谷胺组加胃泌素液及丙谷胺液各150l。置37，5CO2恒温培养箱中培养，每日换液，培养48h后以0.1的胰蛋白酶消化，收集细胞，PBS洗涤2次后用2ml PBS制成细胞悬液，充分打匀

8、，缓慢加入1.5ml冷乙醇固定24h，RNA酶孵育15min，碘化丙啶染色，以外周血淋巴细胞为内参标准，流式细胞仪测定细胞各周期分布。    1.7  统计学处理    按两样本均数比较t检验，计算其统计学差异。    2  结果    2.1  胃泌素及其受体拮抗剂对胃癌细胞活力的影响    胃泌素组吸光度值与对照组比较，P<0.05者表明肿瘤细胞对胃泌素有反应，结果发现54例原代培养的胃癌细胞中34例对胃泌

9、素有反应（63.0%），表现为胃泌素促进细胞的增殖；胃泌素加丙谷胺组和丙谷胺组对细胞增殖均无影响，见表1。    2.2  胃泌素及其受体拮抗剂对原代培养胃癌细胞周期分布的影响    应用流式细胞仪进行细胞各周期分析，结果显示，胃泌素组S期及G2/M期细胞比例明显增加，表明胃泌素可促进细胞DNA合成，使G0/G1期细胞向S、G2/M期转化，加用丙谷胺后胃泌素的上述作用消失，见表2。    2.3  对胃泌素敏感的胃癌临床病理特点    对胃泌素敏感的胃癌原

10、发部位以胃体、贲门部为主，分化程度较差，大多为中晚期，见表3。表1  胃泌素对原代培养胃癌细胞活力的影响注：与对照组比较：#P<0.01，P>0.05；与胃泌素组比较：P<0.01表2  胃泌素对胃癌细胞周期分布的影响注：与对照组比较：P<0.05；P>0.05；与胃泌素组比较：P<0.05；P>0.05 表3  54例原代培养的胃癌病例临床病理特点注：（+）表明胃泌素可促进胃癌细胞的增殖；（-）表明胃泌素对胃癌细胞的增殖无影响3  讨论    3.1  胃泌素对胃癌细胞的

11、增殖作用    新近研究表明，胃泌素可能与其他肽类激素如蛙皮素、胰岛素样生长因子等一样，作为生长因子在胃肠道肿瘤的发生、发展中起重要作用。体外实验证实，在MKN45、Colo205等多种肿瘤细胞中有胃泌素基因的表达1，4，在其细胞表面存在胃泌素受体，外源性胃泌素可促进上述细胞的增殖，联用胃泌素受体拮抗剂后该作用消失。表明胃泌素的增殖作用可能是通过其受体介导的。我们以前的研究证实5，胃泌素作用0.5小时后，MKN45胃癌细胞内cAMP浓度增加；并能明显促进细胞的增殖和DNA合成，使G0/G1期细胞向S、G2/M期转化。联合应用胃泌素受体拮抗剂丙谷胺后细胞增殖减慢、D

12、NA合成减少、G0/G1期细胞比例增加。可见胃泌素起到类似生长因子的作用。为探讨胃泌素及其受体拮抗剂丙谷胺对原代培养胃癌细胞的作用，我们参照Yamaue等3的方法，联合应用酶消化及浓度梯度离心法分离、培养了54例胃癌细胞。结果发现一半以上（34/54）的胃癌细胞对胃泌素有反应，表现为不同程度的促增殖作用，胃泌素组细胞增殖率在25%以上，最高达35.9%。同时应用丙谷胺后该反应消失，而丙谷胺本身对细胞生长无影响。通过对这部分病例的病理特点分析发现，对胃泌素敏感的肿瘤多位于胃体部（13/34）和贲门部（15/34），胃窦部较少（6/34）；以低分化或未分化腺癌为主，且大多属中晚期，其中期15例、期

13、10例。其机制可能为贲门部和胃体部胃癌细胞中胃泌素受体阳性的比例较高；肿瘤的恶性程度越高胃泌素基因的表达水平越高。    3.2  胃泌素受体拮抗剂治疗胃癌的可能性    文献报道，胃癌患者的血清胃泌素水平升高，而高胃泌素血症患者的胃癌发病率增加，胃泌素可能是胃癌发生、发展的原因之一。阻断胃泌素对胃癌细胞的作用，则成为探索胃癌患者内分泌治疗的突破口。本研究发现，当丙谷胺与胃泌素联合作用后，胃泌素的促细胞增殖作用消失，表明丙谷胺在体外能完全阻断胃泌素的增殖效应。但在体内丙谷胺的特异性和敏感性较低，从而影响了临床疗效。但随着胃泌

14、素对肿瘤增殖作用机制研究的不断深入，可望从内源性胃泌素量的调节、受体拮抗剂到受体后信号传导途径甚至胃泌素基因的表达等多个靶点阻断胃泌素对胃癌细胞的作用，以及诱导细胞的凋亡6，这将是胃癌内分泌治疗的研究方向。相信在不远的将来，随着高效敏感的胃泌素受体拮抗剂的问世，必将为胃癌患者开辟一条非细胞毒的内分泌辅助治疗途径。     【参考文献】  1 Matsushima Y, Kinoshita Y, Nakata H, et al. Gastrin receptor gene expression in several human carc

15、inomasJ.Jpn J Cancer Res,1994,85(Supp):819824.    2 Baldwin GS，Zhang QunXing. Measurement of gastrin and transforming growth factor messenger RNA levels in colonic carcinoma cell lines by quantitative polymerase chain reactionJ.Cancer Res,1992,52(15):22612267.   &#

16、160;3 Yamaue H, Tanimura H,Tsunoda T,et al. Chemosensitivity testing with highly purified fresh human tumor cells with MTT colorimetric assayJ.Eur J Cancer,1991,27(10):12581263.    4 Xu Zhidong,Dai Bosong,Dhruva,et al. Gastrin gene expression in human colon cancer cells measured by a simple competitive PCR methodJ.Life Sciences,1994,54(10):671678.