Annexin_PI流式细胞分析法和TUNEL法检测肝细胞凋

1、文章编号 : 1007-6611(2008 05-0476-04Annexin /PI 流式细胞分析法和 TUNE L 法检测肝细胞凋亡的对比研究郭晓红 , 刘立新 3 (山西医科大学第一临床医学院科研实验中心 , 太原 030001; 3通讯作者 , E 2mail :lixinliu6hotmail. com 摘要 : 目的 通过 Annexin /PI 流式细胞分析法和 TUN EL 法检测肝细胞凋亡 , 比较两种方法的优缺点 。 方法 以体外 培养人肝细胞株 HL 27702为研究对象 , 分别设立 TGF 21组 (加入 TGF 21至终浓度为 20ng/ml , 作用 72h 后收

2、集细胞进行检 测 和正常对照组 (加入等量 PBS , 采用 Annexin /PI 流式细胞分析法和 TUN EL 法检测肝细胞凋亡 。 结果 Annexin /PI 流式细胞分析显示 ,TGF 21组与正常对照组相比肝细胞的早期凋亡率和总凋亡率均显著增加 (10. 5571 %vs (5. 982. 97 %, P 0. 01; (19. 943. 68 %vs (13. 274. 62 %, P 0. 05。 TUN EL 细胞 , 细胞呈典型的凋亡形态学改变 , 即表现为变小 、 变圆 、 核固缩 ; 。 图像分析软 件处理 , 显示 TGF 21组与正常对照组相比肝细胞凋亡率显著增加

3、 (6. vs (96%, P 0. 01。 结论 Annexin /PI 流式细胞分析法特异性高 , TUN EL 。 关键词 : 肝细胞凋亡 ; Annexin /PI ; 中图分类号 : Q503 Comparative /and L in detecting hepatocyte apoptosisGUO Xiao 22xin 3Ex perimental Center of Science and Research , First Clinical Medical College , S hanxi Medical U ni 2versity , Taiyuan , China ;3

4、Corresponding author , E 2m ail :lixinliu6hotm ail. com Abstract : Objective To compare the advantages and disadvantages of Annexin /PI with flow cytometry and TUN EL in detect 2ing hepatocyte apoptosis. Methods Cultured human hepatocyte line HL 27702was divided into TGF 21group (treated with TGF 21

5、20ng/ml for 72h and normal control group (incubated with equal PBS . Hepatocyte apoptosis was detected by Annexin /PI with flow cytometry and TUN EL. Results Compared with normal control group ,the percentages of early and total apoptosis signifi 2cantly increased in TGF 21group by Annexin /PI(10. 5

6、54. 71 %vs (5. 982. 97 %, P 0. 01; (19. 943. 68 %vs (13. 274. 62 %, P 0. 05.By TUN EL assay ,nuclei stained buffy were detected as positive cells. Meanwhile the cells changed into smaller ,rounder and nuclear condensation. But normal nuclei were not stained. The percentage of hepatocyte apoptosis in

7、 TGF 21group wasmuch higher than in normal control group(30. 256. 43 %vs (4. 750. 96 %, P 0. 01. Conclusion Annexin /PI with flow cytometry is more specific ,while TUN EL assay is more sensitive. It is more precise to combine Annexin /PI with TUN EL. K ey w ords : hepatocyte apoptosis ; Annexin /PI

8、; flow cytometry ; TUN EL参考文献 :1 Nisolle M ,Donnez J. Peritoneal endometriosis ,ovarian endometri 2osis ,and adenomyotic nodules of the rectovaginal septum are three different entitiesJ.Fertil Steril ,1997,68:585-596.2 戈一峰 , 黄宇峰 , 胡毓安 , 等 . 人子宫内膜细胞的纯化和培养J.医学研究生学报 ,2005,18(6 :496-498.3 谭先杰 , 刘东远 , 郎景

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11、nd immortalization of normal human endometrial cellsJ.Hum Reprod ,2004,19(10 :2192-2199.作者简介 : 韩妍 , 女 ,1975-02生 , 在读硕士 , 主治医师 , 现在长治市人民医院妇产科工作 .收稿日期 : 2007-12-20 基金项目 : 国家人事部留学回国人员择优基金资助项目 (200499 ; 山西省自然科学基金资助项目 (20051092 ; 太原市科技明星专项基金资助项目 (070204004674 ( ( 细胞凋亡 , 即程序性细胞死亡 , 在许多生理和 病理调节过程中发挥着重要作用 ,

12、 其定性和定量检 测无论对于基础研究还是临床用药 , 都有指导意 义 。 随着对细胞凋亡研究和认识的不断深入 , 已有 多种检测方法得到广泛应用 。然而如何选择适当 的方法并对检测结果作出正确的判断及恰如其分 的解释仍是值得探讨的问题 。本研究拟通过磷脂 结合蛋白 /碘化丙啶 (Annexin /PI 流式细胞分 析法和原位末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT 标记法 (TUN EL 法 检测转化生长因子 1(transforminggrowth factor 1, TGF 21 诱导的人肝细胞株凋亡 , 以比较两种方法在测定细胞凋亡时的优缺点 。1 材料与方法 1. 1 材料 人肝细胞株 (HL

13、27702 (科学院细胞研究所 ; TGF 21(;Annexin 2FITC 公司 ; (R &D公司 。 流式细胞仪 (, BD 公司 。 1. 2 方法1. 2. 1 人肝细胞株 (HL 27702 的体外培养 置于含 10%胎牛血清的 RPM I1640培养液中 , 37 、5%CO2条件下培养 , 隔天换液 , 待细胞长至 90%密 度时 ,0. 25%的胰蛋白酶消化传代 。1. 2. 2 分组 TGF 21组 :加入 TGF 21至终浓度为 20ng/ml , 作用 72h 后收集细胞进行检测 。 正常 对照组 :加入等量 PBS 。 1. 2. 3 Annexin /PI 流式细

14、胞分析法检测肝细胞 凋亡 HL 27702以 4104/ml 接种于 12孔板 ,24h 后换为无血清 RPM I1640培养液 , 用终浓度为 20ng/ml 的 TGF 21作用于培养细胞 ,72h 后收集细胞 及其上清液进行 500g 、 4 离心 5min , 弃上清 ;冰 PBS 洗细胞一次 , 重悬 400目筛网过滤 , 计数 , 再次离心 , 弃上清 ; 冰 1binding buffer (一种缓冲液 将细胞调为 1106/ml , 取 100l 细胞悬液加入 5l Annexin 和 2. 5l PI 染液 (终浓度 250g/ml , 轻 轻振荡混匀 , 冰上避光 10mi

15、n ; 加入 400l 冰 1binding buffer 轻轻振荡 ,30min 内进行流式细胞定量分析 。1. 2. 4 TUN EL 法检测肝细胞凋亡百分率 HL 27702以 4104/ml 接种于 12孔板 ;24h 后换为无 血清 RPM I1640培养液 , 加入终浓度为 20ng/ml 的TGF 21,72h 后将细胞用 3. 7%固定 10min ; 经 100%5, ; 50l , 室温 30min , 2次 ; 新鲜配置的 3%H 2O 25min ,PBS 洗 1min ; TdT 标记缓冲液室温孵育 5min ; 每张切片滴加 50l 标记反应混和 液 ,37 1h

16、后用 TdT 终止缓冲液室温作用 5min , PBS 洗 2min 2次 ; 50l Streptavidin 2HRP Detection Solution 室温 20min , PBS 洗 2min 2次 ;DAB 显色 。1. 3 统计学分析 所有数据均以 x s 表示 , 采用 SPSS11. 5统计软件进行分析 , 组间比较用 SN K 2q检验 , 以 P 0. 05为差异有统计学意义 。 2 结果2. 1 Annexin /PI 流式细胞分析法检测 TGF 21诱导的肝细胞凋亡 正常活细胞 Annexin 及 PI均低染 (Annexin -PI - , 分布在流式细胞分析图

17、的左下区 (LL ; 早期凋亡细胞 Annexin 高染而 PI 低染 (Annexin +PI - , 分布在图的右下区 (RL ; 晚期凋亡或死亡细胞 Annexin 及 PI 均高染 (An 2nexin +PI + , 分布在图的右上区 (RU (见图 1 。 将早期凋亡细胞百分数 (RL 和晚期凋亡细胞百分图 1 Annexin /PI 流式细胞分析检测肝细胞凋亡Fig 1 Hepatocyte apoptosis detected by Annexin /PI with flow cytometry774 ( ( 数 (RU 之和称为总凋亡率 。结果显示 TGF 21组与正常对照组

18、相比肝细胞早期凋亡率显著增加 (P 0. 01 , 总凋亡率亦显著增加 (P 0. 05, 见表 1 。表 1 Annexin /PI 流式细胞分析检测肝细胞凋亡的结果T ab 1 The results of hepatocyte apoptosis by Annexin /PIwith flow cytometry( (正常对照组413. 274. 625. 982. 97TGF 2组 8333 与正常对照组相比 , 3P 0. 05, 33P 0. 012. 2 TUN EL 法检测 TGF 21诱导的肝细胞凋亡 细胞核中有棕黄色着染者为凋亡细胞 , 被染上棕色 的细胞呈典型的凋亡细胞形

19、态学改变 , 肝细胞变 小 、 变圆 、 核固缩 ; 而正常细胞的胞核不着染 (见图 2 。 每张切片在高倍视野下 (200 取 5个视野 ,计数 5个视野中每 100个细胞中染色阳性的细胞数(% , 取其平均数 。经 Image 2Pro Plus 图像分析软件处理 , 显示 TGF 21组与正常对照组相比肝细胞 凋亡率显著增加 (P 0. 01 , 见表 。图 2 TUN EL 染色检测肝细胞凋亡 (200Fig 2 Hepatocyte apoptosis detected with TUN EL (200表 2 TUNE L 法检测肝细胞凋亡的结果T ab 2 The results

20、of hepatocyte apoptosis with TUNE Ln凋亡率 (%正常对照组44. 750. 96TGF 21组830. 256. 43# 与正常对照组相比 , #P 0. 013 讨论细胞发生凋亡时首先出现细胞核固缩、 染色质浓集 , 细胞体变圆皱缩等形态学改变 , 在胞质内形成多个膜结构尚完整的 “小泡” 及 “凋亡小体” 1。 同时出现细胞膜的特异性改变 , 原位于胞膜内侧的 磷脂酰丝氨酸 (PS 迁移至脂双层外侧 2, 暴露于细 胞外环境中 , 但细胞膜仍保持完整 。另外 , 核酸内 切酶被激活 , 将 DNA 降解 , 形成长度为 180-200bp 的 DNA 片

21、断 。 而坏死细胞 DNA 断裂无规律性 。1995年 Vermes 等 3首先利用对 PS 有高度亲 和力的 Annexin 检测细胞凋亡 。由于坏死细胞 PS 亦暴露于细胞膜外表 , 使 Annexin 结合阳性 , 因此单独用 Annexin 不能区分细胞坏死或凋亡 , 必须同时采用 PI 这一坏死细胞染色阳性的染料将 坏死细胞区分出来 。所以 , 用荧光标记 Annexin 与 PI , 通过流式细胞仪可同时区分活细胞 、 凋亡早 期和凋亡晚期或坏死细胞 4。本研究用该法检测 TGF 21诱导的肝细胞凋亡 , 结果显示 :终浓度为 20ng/ml 的 TGF 21作用于培养细胞 72h

22、 后 , 无论是 肝细胞的早期凋亡率还是总凋亡率均较正常对照组显著升高 (P 0. 01, P 0. 05 。细胞凋亡中染色体 DNA 的断裂是个渐进的分 阶段过程 , 染色体 DNA 首先在内源性核酸水解酶 的作用下降解为 50-300kb 的大片段 。然后大约 30%的染色体 DNA 在 Ca 2+和 Mg 2+依赖的核酸内切酶作用下 , 在核小体单位之间被随机切断 , 形成 180-200bp 的寡聚核苷酸 。 DNA 双链断裂或只要一条链上出现缺口即产生一系列的 DNA 3 -OH 末端 , 可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶 (Td T 的作 用下 , 将脱氧核糖核苷酸和辣根过氧化物酶形成

23、的 衍生物标记到 DNA 的 3 -末端 , 而正常的或正在 增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂 , 没有 3 -OH 形 成 , 很少能够被染色 。因此可进行凋亡细胞的检测 , 即 TUN EL 法 5。本研究据此检测 TGF 21诱 导的肝细胞凋亡 , 结果显示终浓度为 20ng/ml 的TGF 21作用于培养细胞 72h 后 , 肝细胞凋亡率亦 874 ( (显著高于正常对照组 (P 0. 01 。Annexin /PI 流式细胞分析法和 TUN EL 法 是检测细胞凋亡的两种常用方法 。 TUN EL 法是分 子生物学与形态学相结合的研究方法 , 对完整的单 个凋亡细胞核或凋亡小体进行

24、原位染色 , 能准确地 反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征 , 广泛 应用于石蜡包埋组织切片 、 冰冻组织切片 、 培养细 胞以及组织分离细胞的凋亡测定 , 可检测出极少量 的凋亡细胞 , 灵敏度高 。它利用 DNA 的断裂来标 记凋亡细胞 , 不需要特殊仪器 , 方法简单易行 。但 TUN EL 法亦有它的局限性 6-8: 只能标记中期 及晚期的凋亡细胞 ; 细胞坏死时也会发生 DNA 断裂而被 dU TP 标记 , 因此不能区别凋亡和坏死细 胞 , 并会将坏死细胞计入凋亡细胞 , 特异性较差 标记过程中需固定细胞 ,DNA 片段丢失 ; 影响 。亡远高于 PI果 (30. 256. 4

25、3 vs (19. 943. 68 %, 可能也 提示它的特异性差 。细胞凋亡时细胞膜上的 PS 外露 , 使细胞膜丧 失不对称性是细胞凋亡的早期事件 2,9, 早于 DNA 断裂 3, 且通过 Annexin 与 PS 特异性结合 、 PI 与 坏死细胞结合可将凋亡细胞与坏死细胞区分开来 , 因此用 Annexin /PI 流式细胞分析法能更灵敏 、 特 异地检测早期凋亡细胞 。此法进行荧光标记后直 接上机检测 , 不需固定细胞 , 避免了 TUN EL 法因 固定出现的 DNA 片段丢失 , 并且不受主观因素影 响 , 简单 、 快速 , 结果更可靠 。 但晚期凋亡和坏死细 胞的胞膜均已破

26、坏 , PS 也暴露于胞膜外侧 , 不能区 分晚期凋亡与坏死细胞 。试剂盒价格昂贵也限制 了它的广泛应用 。尽管有透射电镜或荧光显微镜形态学观察 、 DNA 凝胶电泳 、 EL ISA 法 、 PI 单染色法以及 cas 2 pase 23活性检测等多种方法检测细胞凋亡 , 但每种 方法各具特点 , 均有其局限性 , 目前尚无一种完美 的检测手段 。因此在凋亡检测中应避免使用单一 方法 , 需考虑实验室条件 、 样本来源和研究目的 , 选 择两种或两种以上的方法 , 检测细胞在凋亡发生过 程中的不同事件 , 才能更准确 、 客观 、 全面地反映实 验结果 。参考文献 :1 Hacker G.

27、The morphology of J .Cell Tissue Res , 2000,301(1 :5-17.2 VA , et . Exposure of phos 2 on the triggers by macrophagesJ.J Immunol , (2216.3I ,Haanen C ,Steffens 2Nakken H , et al . A novel assay for apoptosis flow cytometric detection of phosphatidylserine expres 2 sion on early apoptotic cells using fluoresce in labeled Annexin J.