应用分子生物学技术对环境中军团菌的调查研究

1、应用分子生物学技术对环境中军团菌的调查研究沈莉 谢晓红 韩华忠 陶力新 袁建华 王仁刚上海市奉贤区疾病预防控制中心 201400摘要目的： 应用分子生物学技术对奉贤地区部分公共场所空调冷却塔水及其它环境（淋浴设施等）进行军团菌污染状况调查。方法：在五月和十月，分别采集中央空调冷却塔水样品及环境样品用聚合酶链（PCR）对其进行军团菌检测，同时用常规法进行分型鉴定。结果：采集的125份样品中，PCR法检出军团菌45份，阳性检出率为36%，且水样检出率远高于环境。在检出的59株军团菌中共鉴定出6种不同菌型，其中LP1为重点菌型，占50.85%。且在同一样品中检出不同菌型有2株以上的占35.29%。结

2、论：奉贤地区中央空调冷却塔及环境中存在军团菌污染，需引起重视，以防止军团菌的爆发流行。关键词：军团菌 冷却塔 PCRApplication of molecular biology technology on the environment in the investigation of Legionella Shen li,Xie Xiaohong,Han Huazhong,et al .Fengxian district Center for Disease Prevention and Control,shanghai201400,china.AbstractObjective：Maki

3、ng a survey by techniques of Applied Molecular Biology, which is about the condition of Legionella contamination in air-conditioning cooling tower water and other environments (shower facilities, etc in some public places in Fengxian District.Methods：In May and October, inspecting the samples of cen

4、tral air-conditioning cooling tower water and other environments respectively on Legionella by polymerase chain (PCR, while making a classification identification by routine techniques. Results：Among the 125 samples collected, Legionella was found in 45 samples by PRC, relevance ratio of masculine g

5、ender was 36%, which was higher in water than in other environments. There were 6 different bacteria types identified in the detection of 59 pieces of Legionella. LP1 was the important bacteria type among the 6, accounting for 50.85%. The fact that more than 2 types in one sample accounts for 35.29%

6、.Conclusions：Legionella contamination exists in air-conditioning cooling tower water and other environments in Fengxian District, which should be paid attention to in order to prevent the outbreak of Legionella.KeywordLegionella ;Cooling tower ;PCR军团菌是一种革兰氏阴性杆菌，能引起急性呼吸道传染病1，因在1976年美国费城召开的退伍军人大会时爆发流行

7、而得名。自70年代被发现以来，全世界已有广泛报道，全球每年都有数起军团菌爆发流行，WHO也已正式把它列入疾病传报范围。迄今为止，军团菌已被发现存在40个种，60多个血清型。经流行病学调查研究，这种细菌存在于各种自然界水源以及空调水管道，供水系统等人工水源中，在引进空调冷却塔做冷却水时，随空调器把细菌散布于室内空气中，被人吸入而引发肺炎。我国自1982年南京首次证实军团菌病例以来已有多起军团菌爆发流行2，上海在近几年内也从病人和环境中分离到军团菌3。而上海地区健康人血清抗体水平调查也证明军团菌早已存在我们周围并对人群构成潜在威胁4。近年来从军团菌的流行可以看出军团菌对人类健康的威胁已达到不容忽视

8、的程度。随着人们生活水平的提高，其发病率有上升趋势，因此对该病的研究也越来越受到人们的重视。目前用于军团菌检测的常规培养费时约7-10天，不仅花费大量时间和精力，还具有敏感性，特异性差的缺点，且操作复杂，易造成漏检和误检。分子生物学技术的发展为军团菌检测提供了新的契机。利用聚合酶链（PCR）技术能够更加快速和有效的对军团菌进行检测。本课题应用聚合酶链（PCR）技术，检测流行环境中的军团菌，了解分析奉贤地区军团菌的污染状况。1 材料与方法1.1 材料培养基 GVPC平板由柯玛嘉公司提供，血琼脂平板，各反应试剂由上海市疾病预防控制中心提供，均在有效期内使用。1.2 方法2培养72小时后进行鉴定5。

9、2 结果2.1 PCR检测结果一共采集125份样品进行嗜肺军团菌的检测，有45份样品检出阳性。经上海生工生物工程有限公司测序验证,送检的阳性样品扩增产物确认为嗜肺军团菌。M:100bpDNA标准带；1:嗜肺军团菌阳性对照;2:阴性对照;3-15:部分样品扩增条带特异性引物只与嗜肺军团菌发生阳性扩增，扩增长度为430bp，其它干扰菌没有扩增产物，具有很好特异性。结果见图2。M:100bpDNA标准带；1: 嗜肺军团菌;2:空白对照(不加模板; 3: 肠炎沙门菌; 4:宋内氏志贺菌; 5:大肠埃希菌; 6:副溶血性弧菌 2.2 样品检测情况用PCR检测的125份样品中，水样64份，环境样品61份，

10、水样的阳性检出率远远高于环境中的阳性检出率。经统计学分析，水样与环境样品检出率的比较（X2 =55.37， P0.05），有显著性差异。详见表1表1: PCR法检测125份军团菌样品情况样品种类 检测件数 阳性数（份） 阳性检出率（%） 水样 64 43 67.19环境 61 2 3.28 合计 125 45 362.3 两种方法检测结果比较64份水样样品中PCR法检测出阳性菌43份，阳性检出率67.19%。常规法检出阳性数32份，阳性检出率为50%，略低于PCR法。经统计学分析，两种方法检出率比较（X2 =3.90，P0.05），有显著性差异。而在环境样品中，由于阳性检出率很低，无明显差别。

11、详见表2、表3表2: 水样样品中两种方法检出情况检测方法 检测件数 阳性数（株） 阳性检出率（%） PCR法 64 43 67.19常规法 64 32 50 合计 128 75 58.59表3: 环境样品中两种方法检出情况检测方法 检测件数 阳性数（株） 阳性检出率（%） PCR法 61 2 3.28常规法 61 2 3.28 合计 122 4 6.562.4 军团菌的菌型分布情况在125份样品中检出了59株军团菌。其菌型分布为LP1型占50.85%，LP4型占23.73%，LP5型占10.17%，LP6型占8.47%，LP7型占3.39%，LP8型占3.39%。而同一份样品中检出3株菌型的有

12、4份，占阳性样品的11.76%，同份样品检出2株菌型的有8份，占23.53%。详见表4、表5表4：125份样品59株军团菌的菌型分布情况样品种类 菌株检出数 嗜肺军团菌菌型 LP1 LP4 LP5 LP6 LP7 LP8水样 57 30 14 6 3 2 2环境 2 2合计 59 30 14 6 5 2 2表5：同份样品检出多重菌株情况同份样品检出菌株数 样品数（份） 所占百分比（%）3株 4 11.762株 8 23.531株 22 64.71合计 34 1003 讨论3.1 这次对奉贤地区大型中央空调和部分环境的军团菌污染调查中发现，中央空调冷却塔水中的阳性率达67.19%，远高于环境中的

13、阳性率3.28%，证明空调冷却水军团菌污染相当严重。冷却塔作为中央空调系统的一部分，其产生的循环水不仅为军团菌提供了理想的生存环境6 ，而且提供了传播的形式气溶胶。冷却塔水被污染后，通过空调机入口和通风管被抽入室内或在冷却塔一定范围形成气溶胶，人引吸入而被感染。空调系统冷却塔污染是导致军团菌感染的主要原因之一7 ，由于军团菌是一类水生菌群，生存环境界限广泛，水中存活时间较长，因此水质的跟踪检测及水的消毒十分重要。3.2 在此次的调查中，检出了6种不同菌型，显示了军团菌血清型呈多样化发展的趋势。而其中又以LP1为重点菌型，占检出菌的50.85%。这与之前国内报道的军团菌分布情况一致8。而且在同一

14、样品中检出了不同菌型，2株以上的占35.29,%，证明了在空调冷却塔水中存在着严重的多重污染，再次证明奉贤地区军团菌污染状况岌岌可危。由军团菌污染环境可能导致严重后果应该引起我们足够的重视。3.3在军团菌的研究中从流行环境中检出的菌株以空调系统冷却塔水较多，而此次我们在酒店的浴室莲蓬头中检出了2株军团菌，这属少见，也充分说明军团菌就存在我们日常生活中。提醒市民对自己家里的淋浴器等设备也要进行定期检测，消毒，清除水垢，污物。军团菌爆发流行的可能性正日益临近。居民小区的集中供水，加湿器，热水器，空调器的日益普及无时不刻提醒我们卫生管理部门急需重视这个文明病。3.4 由于军团菌的培养分离方法繁琐，人

15、工培养条件的苛刻及其生长代谢的缓慢导致标本检出率低下，从而造成事实上的假阴性，漏检。检测技术相对滞后，对于军团菌的预防与治疗十分不利。PCR方法检测军团菌完全是从细菌的基因水平入手，针对5SrRNA设计的属特异性引物，从而比以往所有传统的外显蛋白质表型检测更为可靠。而运用聚合酶链反应技术（PCR）的高敏感性，强特异性和快速等特点，可以克服常规检验技术的缺陷,显著简化了操作，有利于军团菌防治工作的开展。而此次运用两种方法对军团菌的调查分析中也可以看到，PCR方法的阳性检出率要高于常规法的检出率。3.5 军团菌病约90%是由嗜肺军团菌所致，某些军团菌含有的巨噬细胞感染增强基因（mip）看调控24-27KD外膜蛋白形成，这种蛋白可以使正常身强体壮的人患病。这使得过去认为军团菌为条件致病菌的理论受到看极大冲击，也使得这种可通过气溶胶传播的呼吸道传染病变得日益恐怖。军团菌造成的空气污染和水源污染正是发展中城市的一个公共卫生问题。因此，加强军团菌监测，建立快速的检测技术，努力做好防范工作是我国卫生管理部门亟待重视和解决的问题之一。目前，尚无军团菌相关疫苗，无人-认传播的有效证据。所以加强对军团菌重要传染源-水系统的卫生管理，是预防军团菌发生和流行的关键。参考文献：1朱水荣,叶菊连,孟真,等.浙江省首次从空调冷却塔水中分离到军团菌J.中华流