小麦中Actin基因的分离和连接转化

1、 小麦中Actin基因的分离和连接转化 摘要：上世纪七十年代末，分子克隆技术已应用于肌动蛋白基因研究，植物肌动蛋白基因与动物及真菌肌动蛋白基因一样，属于多基因家族基因。它是一种广泛参与真核细胞生理过程的管家基因,在基因表达调控研究时被广泛用作分子内标。现在已经在很多植物中都已克隆到Actin 基因，但是不同的植物Actin基因的拷贝数有很大的差别。本实验以小麦为材料对其细胞中的Actin基因进行分离、连接、转化，从而对Actin基因有更好的了解，并在此次实验中学会DNA的提取、克隆、转化的操作方法。本实验采用CTAB法提取小麦中的DNA。该方法无论是新鲜材料或经脱水处理的材料均可使用。虽然得到

2、的DNA纯度并不很高，但仍能满足限制性内切酶分析或PCR扩增的要求。关键词：小麦、Actin基因、分离、连接、转化、PCR。肌动蛋白（actin） 是真核生物中普遍存在的一种重要的蛋白质，是构成细胞骨架和肌肉肌小节的主要成分，执行着重要的生理功能。它最早在动物骨骼肌细胞中被发现,我国科学家阎隆飞等首次证明了植物肌动蛋白的存在。单体肌动蛋白为球蛋白，一般由375-377个氨基酸残基组成，分子量约为42KD。由于Actin基因在各种组织中恒定表达，因而常被作为一种重要的看家基因以比较不同来源的目的基因表达量的差异。肌动蛋白广泛存在于高等植物的各种组织细胞中,如花粉、 茎韧皮部、 叶表皮细胞、 叶鞘

3、细胞、 根毛、 卷须等。在植物中,以肌动蛋白和微管蛋白为基础的细胞骨架,它或是与质膜相关,或是横贯细胞质,不同程度的影响了细胞分裂、 细胞分化、 细胞内囊泡运输、 细胞壁的生物合成、 共生现象、 胞吞胞吐作用以及膜的循环利用等。植物肌动蛋白的保守性、 植物肌动蛋白的组织表达特异性、植物肌动蛋白体内聚合与调节。迄今为止，已在许多高等植物，如拟南芥、水稻、白杨、玉兰、谷子、花生、水花生等中克隆到了Actin基因。本实验采用CTAB法提取小麦中的DNA。该方法无论是新鲜材料或经脱水处理的材料均可使用。虽然得到的DNA纯度并不很高，但仍能满足限制性内切酶分析或PCR扩增的要求一、材料与方法：1、 材料

4、：从陕西师范大学对面的毛坡地摘取的新鲜幼龄小麦叶、2、 菌种：E. coliDH5a感受态细胞3、 方法： （1）DNA提取：1 小麦中DNA的提取（本实验采用CTAB法提取小麦中的DNA。优点：本方法无论是新鲜材料或经脱水处理的材料均可使用。虽然得到的DNA纯度并不很高，但仍能满足限制性内切酶分析或PCR扩增的要求。）液氮下冷却研磨的2克小麦叶分别装到4个1.5毫升的离心管中（每个管中都已先加入700微升TCAB缓冲液），平均每个离心管加0.1克研磨粉末，轻轻转动离心管使植物组织在提取缓冲液中均匀分散，65温育90min，并不时轻轻转动离心管。取出混合物冷至室温后向每管加入700微升氯仿/异

5、戊醇。轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液。8000rpm离心10min。 将上清液（水相）转移至一干净离心管中，每管中的上清液为540微升。加入0.7体积的异丙醇（378微升），仔细混匀，室温放置15min沉淀DNA.用一玻璃钩将DNA钩出，并转移至一装有1000微升76%乙醇，0.2mol/L乙酸钠的干净离心管中，冰上放置5min，然后转移至一装有5mL70%乙醇的离心管中，冰上旋 转5min。将DNA转移至一干净管中，空气干燥15min，溶于尽可能少的TE缓冲液中（可多达5mL，视DNA的量和纯度而定）。若要使DNA样品加速溶解并除去其中残留的DNase活性，可置于65水浴加热10mi

6、n。4贮存.4、PCR扩增：（1）构建PCR反应体系 1l  模板DNA   10l  2×PCR Mix   0.5l  引物    0.5l  引物            8l  H2 O  总共：20l体系。（2）PCR反应程序设计（参考基础实验，可设置不同退火、延伸温度的对照，最后电泳检测那种效果最好）94  3min&

7、#160;  94   30s   62 30s    35cycles72 30 s    72   10min        4 forever（3） PCR反应结束后，取3ul反应液加入 loading buffer 2.5l混匀, 1琼脂糖凝胶电泳检测。5、目的片段的分离与回收纯化用干净无菌的刀片在 365 nm紫外光下切割目的DNA条带，放入1.5mL Ep管中，积累凝胶至大约

8、300ul。（尽量将不含有DNA片段的空白凝胶切掉，以节约溶胶液，并提高回收效率。不要将疑胶长时间暴露在紫外灯下超过30秒，以减少紫外线对DNA的破坏。）在装有凝胶的离心管中加入溶胶液（500ul/0.1g）， 65水浴5-10min或直到凝胶完全溶解。再按照100mg每块加入150u1的比例加入异丙醇，混匀。胶块完全溶解后将溶胶液转移至吸附柱中，室温12000rpm离心30s；去掉废液；重复步骤有助于增加DNA结合效率，提高回收率。向吸附柱中加入500ul漂洗液(Wash buffer）12，000rpm离心30s。倒掉废液。重复步骤，倒掉废液后空管12，000rpm离心2min以完全去除漂

9、洗液。必要时可将吸附柱开盖置于洁净空气放置5min，否则残存的乙醇会影响后续酶促反应。 将吸附柱移至一个干净的1.5ml离心管中，向吸附柱膜中央加入适当体积的洗脱缓冲液(Elution buffer，通常用30-50ul)或去离子水，室温放置1-2分钟，12，000rpm离心2min洗脱DNA。（将洗脱液预热至70加入到吸附柱中有助于洗脱，洗脱的最小体积不应小于25 ul） DNA-20度保存。6、actin基因与T-easy载体的连接 连接反应体系建立（参考T-easy载体连接说明）： 含有质粒载体的DNA溶液： 4 l； 插入actin基因片段溶液： 12 l； 10X T4 DNA li

10、gase buffer： 2 l； T4 DNA连接酶： 1 l 灭菌的双蒸水： 1 l 总体积为20l 涡旋后混合均匀，涡旋至无气泡。 4连接过夜。7、感受态大肠杆菌的制备： 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中，37180rpm振荡培养过夜； 将该菌悬液以1:100的比例接种于100ml LB液体培养基中，37振荡培养12小时至OD600在0.4左右 ; 无菌条件下取1ml菌液到预冷的1.5ml离心管中，4, 5000rpm离心4min； 重复步骤 3）3次，收集足够的菌； 彻底弃上清液，在冰浴上加入1/10V（400ul）预冷的无菌Ca

11、Cl2 (0.lmol/L)，轻轻吹打，使细胞悬浮，冰浴10 min； 4，5000 rpm离心5min，弃上清液; 用200l预冷的无菌CaC12 (0.lmol/L) 重新悬浮细胞，100ul分装，冰上备用；（注：如果需要保存，用160ul 预冷的无菌CaC12 (O.lmol/L)和40ul无菌的70%甘油悬浮细胞，液氮冷激10min后，-70以下保存备用。）8、转化取100l感受态细胞悬液，在冰浴中使其解冻，加入10l连接产物（或质粒DNA）(含量不超过50ng，体积不超过10l)，轻轻摇匀，冰上30min； 42水浴中热击90秒（勿摇动），热击后迅速置于冰上冷却2min； 向管中加入

12、400ul LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37，70100rpm振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )； 离心：将上述菌液 3000rpm 离心 2min后，弃上清300ul，剩下的菌液混匀；涂平板：将上述混匀后的菌液取80-100ul涂布于含Amp的筛选平板上，37倒置培养皿培养1216h。 注意：1、含Amp的LB固体培养基的配制:将灭菌的LB固体培养基水浴溶解后冷却至60左右，加入Amp储存液，使终浓度为100ug/ml，摇匀后到平板；9、阳性克隆的筛选：能够在平板上生长的菌落就有可能是含actin基因的大肠杆菌。 10、阳性克隆的鉴定：

13、将在平板上长出的菌落各取一小部分并对其DNA提取，进行PCR扩增，1琼脂糖凝胶电泳检测。 二、结果与分析1、小麦DNA的提取：从小麦中提取的DNA在1琼脂糖凝胶电泳检测，得到的结果如下图相：第二排的最右边四个样孔是我们这组点的样，从四个跑道可看到明显的DNA条带分析：从图像可知DNA提取较成功2、actin片段的扩增：以小麦DNA为模板经PCR扩增后的产物于1琼脂糖凝胶电泳检测，得到的结果如下图相：分析：从上图可知此次actin基因片段提取成功（最左边的那个点样孔是我们这组点的，通过与Marker条带的对比，发现该条带位于1000-2000之间，符合要求）3、actin片段的克隆：将PCR扩增

14、产物回收后，将纯化的目的片段连接到T-easy载体上，转化E. coli DH5感受态细胞，在平板上长出了2个菌落。 分析：此次实验得到的菌落较少，原因可能有a. 在回收时,目的基因过长时间的暴露在紫外线下，损害较严重 ；b. 制取感受态细胞时取得的细胞大部分是已经过了对数生长期的，使得转化低效；c. 受到杂菌的污染。4、 阳性克隆的鉴定：将菌落培养液为模板，对目的片段进行PCR扩增，在1琼脂糖凝胶电泳检测得到的电泳结果显示如下： 分析：凝胶电泳中没有actin片段的条带，说明此次实验转化失败。在平板上长的5个菌落是假阳性的。（最右边的四个点样孔是我们这组的） 三、讨论：研究清楚了Actin基

15、因，可以帮助我们更好地认识肌动蛋白，从而从基因水平对肌动蛋白的功能进行调控，使之更充分地发挥以下作用： 肌动蛋白与细胞质的流动，细胞器的运动密切相关，影响这细胞分裂，生长和代谢等生命活动。 肌动蛋白与植物根毛和花粉管顶端生长有着密切联系，然而花粉萌发和花粉管伸长是高等植物有性繁殖的重要环节。 肌动蛋白控制这细胞的形状，同时也影响着细胞有丝分裂需要的微管和微丝的形成。肌动蛋白通过微丝的作用间接影响叶绿体的运动，当然也就影响着植物生长过程中处于关键地位的光合作用。 通过此次实验，我们更好的掌握了DNA分离、连接、转化、PCR的操作方法，也对Actin基因有了进一步的了解。 四、引用文献： 刘雄 阎

16、隆飞，植物肌动蛋白研究的过去及现状； 伍国强 席杰军 包爱科 王锁民，多浆旱生植物霸王Actin基因片段的克隆及序列分析； 张少斌 刘国琴，植物肌动蛋白异型体研究进展； 王荣 张根发， 拟南芥生长受体基因TIR1启动子的克隆及序列分析； 田秀红 高建明 肖强 崔翠菊 何光源，水花生Actin基因片段的克隆及序列分析； 李岩 李冠， 光叶楮肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析； 阎隆飞 刘国琴 肖兴国，从花粉肌动蛋白到作物雄性不育； 黄绍兴 刘俊君 阎隆飞 彭学贤，肌动蛋白基因在豌豆幼苗的发育阶段和器官特异性表达；周海飞 赵武玲 阎隆飞. 玉兰肌动蛋白基因的克隆与序列分析阎隆飞,王秀珍,滕晓月,刘国琴,马永泽. 花粉中的肌动蛋白和肌球蛋白及其在花粉管伸长中的作用黄绍兴 刘俊君 阎隆飞 彭学贤. 在丝瓜和黄瓜发育过