一株海洋琼胶酶产生菌的分离筛选和初步鉴定

1、一株海洋琼胶酶产生菌的分离、筛选和初步鉴定刘美英，梅建凤，应国清基金项目：浙江省科技计划项目（2007C33068）作者简介：刘美英，女，硕士研究生 *通讯作者：应国清，男，教授，硕士生导师 Tel: (0571) 88871029 E-mail: gqying，王鸿（浙江工业大学药学院，浙江 杭州310014）摘要：目的 从海水中分离活性较高的琼胶酶产生菌，以制备琼胶酶用于琼胶寡糖的生产，琼胶寡糖具有多种生物活性，在食品、化妆、医药等行业有广阔的应用前景。方法 以琼胶为唯一碳源，用稀释涂布平板法进行分离，平板透明圈法进行初筛，摇瓶培养法进行复筛，改进的DNS比色法进行酶活力的测定。结果 从海

2、水中分离筛选到18株琼胶降解菌株，经复筛得到一株产酶活力较高的海洋细菌HS0326-601，并对该菌株进行了初步鉴定，结果表明其为革兰氏阴性细菌，菌体呈短杆状。结论 鉴于该菌株生长速度快，通过对其进一步的诱变和发酵条件优化，有望成为高产琼胶酶产生菌，从而为琼胶酶、琼胶寡糖的深入研究和开发应用奠定基础。关键词：琼胶降解菌；琼胶酶；分离；筛选中国分类号： 文献标识码：A 文章编号：0000-0000(2008)00-0000-00Isolation, Screening and Identification of AgaraseProducing Bacteria from the Seawate

3、rLIU Mei-ying, MEI Jian-feng, YING Guo-qing*, WANG Hong (College of pharmaceutical science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)ABSTRACT: OBJECTIVE To degrade agar into agaro-oligosaccharide by the agarase with a higher activity, the strains were separated from seawater. The ag

4、aro-oligosaccharide have shown wide application values in food industry, cosmetic industry, pharmaceutical industry and other sectors. METHODS The agarase-producing baceria were isolated by the spread plate method, first-screening by clear halos on agar plate containing agar as the sole-carbon sourc

5、e, second-screening of shaking culture. The enzymatic activities were determined by improved DNS colorimetry method. RESULTS 18 agar-degrading strains were isolated from the seawater, and a more powerful agarase-producing marine bacterium was obtained. The strain was designated as strain HS0326-601

6、and identified preliminarily as Gram negative, rod-shaped. CONCLUSION With regard to its high growth speed, if further treated with mutagens, the strain might be one with a high enzymic activity after fermentation optimization, and it could be used to the further study and applied to the preparation

7、 of agarase for agaro-oligosaccharide production in industry. KEY WORDS: agarase-producing bacteria; agarase; isolation; screening琼胶（agar）是一种从海洋红藻中提取得到的多糖，其在食品、医药卫生等行业已有悠久的应用历史，但由于琼胶黏度高，水溶性低，不易被吸收，因此在应用方面受到很大的限制。而琼胶寡糖（agaro-oligosaccharide），即琼胶多糖经水解后聚合度为210的低聚糖，又称琼胶低聚糖，主要由琼二糖的重复单位连接而成，水溶性好，有利于人体吸收，大

8、大提高了其应用价值，琼胶寡糖具有较强的抗癌1, 2、抗氧化3, 4、抗炎2, 5及抗病毒1, 6等活性，是一种极具开发潜力的低聚糖。琼胶酶能降解琼胶生成琼胶寡糖, 与琼胶的化学降解相比，琼胶酶降解琼胶则具有特异性强的优点，可选择性地酶解切断特定化学键，从而制得特定聚合度的寡聚糖，并且具有反应条件温和，降解过程易于控制，无副反应，环境污染少等优点，在制备琼胶寡糖中具有明显的优势。除了制备琼胶寡糖之外，琼胶酶还可用作工具酶、用于回收DNA或RNA、海藻多糖结构的研究等7, 8。我国对于海藻多糖降解酶的研究尚处于起步状态，进行的研究大多局限于产酶菌株的筛选、酶的制备、纯化与性质分析、及酶的应用等方面

9、，还未见关于其投入规模化发酵生产的报道，关键就在于缺乏酶活力高的菌株9。因此筛选高产琼胶酶产生菌具有重要的理论意义和应用价值。目前，琼胶酶产生菌可以从海水、海洋动物肠道、底泥等海洋环境以及湖泊、河流、排污口等陆地环境中获得1, 1012，甚至从菠菜根系中也可筛选到琼胶降解菌株13，但大多数琼胶酶产生菌从海洋环境中分离得到1。本实验先后从舟山、台州等地采集海水样，从中分离筛选到一株活力较高的菌株，并对其进行了初步鉴定。旨在为琼胶酶、琼胶寡糖的深入研究和开发应用提供基础。1 材料与方法1.1 材料 海水样品 取自浙江舟山册子岛、金塘和朱家尖等藻类繁殖地和台州温岭箬横、坞沙门及三门等紫菜养殖地海水。

10、 培养基组成 分离培养基（%）：NaCl 2.5；NH4Cl 0.1；MgSO47H2O 0.5；KCl 0.1；FeSO47H2O 0.002；CaCl2 0.02；NaH2PO4 0.06；琼脂 2；pH 7.0。 斜面培养基（%）：NaCl 2.5；酵母浸出粉 0.5；MgSO47H2O 0.5；KCl 0.1；FeSO47H2O 0.002；CaCl2 0.02；NaH2PO4 0.06；葡萄糖 0.1；琼脂 2；pH 7.0。 复筛培养基（%）：琼脂 0.2；酵母浸出粉 0.25；其他成分同海水分离培养基。以上培养基均为121 、20 min灭菌；液体培养基装量为35 ml/250

11、ml摇瓶。1.2 方法 海水样品的采集 采集海水样品装于塑料瓶中，紫菜等样品装于样品袋中。采集的样品置于4冰箱保存。 样品的驯化富集 取琼胶适量，海水样品40 mL，在酒精灯旁加入250 mL锥形瓶中，28 、200 rmin-1连续振荡培养，定期加入适量蒸馏水至原体积，目测培养液明显混浊后，取培养液4 mL接种于含琼胶5g、36 mL该海水样品的三角瓶中，重复上述培养过程。 菌株的分离 采用稀释涂布平板法：用无菌移液管吸取海水或富集样品5 mL，加入含一层玻璃珠和45 mL无菌人工海水的三角瓶中，200 rmin-1振荡30 min，混匀制成菌悬液，用无菌人工海水适当稀释，移取0.2 ml涂

12、布于分离培养基平板上，28 培养，直至平板上长出菌落。1.2.4 菌株的初筛观察平板上菌落形态，挑取周围形成明显凹陷的菌落，并在平皿底部作标记，再滴加卢戈氏碘液染色。保留那些平板上能产生透明圈菌落的对应斜面，弃去染色后无透明圈菌落的对应斜面，将前者置于28 培养，供复筛用。1.2.5 菌株的复筛用接种环挑取初筛菌株的新鲜斜面菌苔2环，接入复筛摇瓶培养基中，28 、200 rmin-1发酵培养48 h。将发酵液于3000 rmin-1下离心10 min后取上清液测酶活力，筛选出产酶活力最高的菌株进行纯化。1.2.6 菌种纯化用接种环挑取复筛得到的新鲜斜面种菌苔，用无菌人工海水适当稀释，取0.2

13、mL涂布于分离培养基平板上。28 培养，直至平板上长出菌落，将单菌落挑至斜面上培养。然后进行复筛，方法同，筛选出产酶活力最高的菌株用于发酵产酶。1.2.7 琼胶酶活力的测定 粗酶液的制备 将发酵液于3000 rmin-1下离心10 min后上清液即为粗酶液。 改进的DNS比色法测定琼胶酶活力 用pH 7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配制0.2 %的琼胶底物溶液20 mL。加入4 mL待测酶液，35 、150 rmin-1摇床反应1 h。立即取1 mL反应液于带有刻度的试管中，加入0.5 mL DNS溶液于沸水浴中共热5 min后立即冷却至室温，定容至10 mL。测520 nm波长处

14、的吸光度。 酶活力单位定义 在上述反应条件下，1 mL酶液1 min产生l g还原糖为一个酶活（U）。 菌体浓度的测定 采用紫外-可见分光光度法在620 nm 波长下测定培养液的吸光度。1.2.9 菌株的初步鉴定琼胶降解菌株的初步鉴定按参照文献14进行。首先观察菌落形态、镜检观察个体形态，革兰氏染色，再作进一步鉴定。2 结果与分析2.1 琼胶降解菌株的筛选 菌株的初筛在对舟山、台州各地的海水样进行早期筛选后发现，温岭箬横紫菜养殖地的海水样中的琼胶酶产生菌较多，且产酶活力也较高。故在本研究中对该海水样进行驯化富集，以琼胶为唯一碳源进行富集培养，以期获得更多、酶活力更高的琼胶降解菌株。平板培养后用

15、卢戈氏碘液染色，琼胶与碘结合而被染色。产琼胶酶的菌株，由于其菌落周围琼胶被降解形成琼胶寡糖，而琼胶寡糖具有还原性，不能着色，因此其菌落周围可形成透明圈，这样便可以很好地从海水样中分离筛选到琼胶降解菌。观察培养基平板可发现菌落所在的培养基呈釜底形凹陷，并且有较大的透明圈，筛选的平板透明圈见图1。采用此法，分离到了18株琼胶降解菌，分别测定其菌落直径和透明圈直径，结果见表1。图1 琼胶酶筛选平板经卢戈氏碘液染色后的照片Fig. 1 Photograph of the agar plate stained by Lugols for agarolytic strains screening表1 18

16、株琼胶降解菌菌落直径和透明圈直径Tab. 1 Diameter of colony and halo from 18 strainsStrainsDiameter of colonies (DC ) /cmDiameter of inner clear halos (DH ) /cmHC value (DH / DC)10.2140.4382.04720.2300.4662.02630.2020.4282.11940.1620.3602.22250.1860.3902.09760.5241.0181.94370.1200.3042.53380.2400.4842.01790.2160.3981

17、.843100.1980.4122.081110.1000.2862.860120.0540.2083.852130.1180.2462.085140.2140.5362.505150.1880.4882.596160.8302.0162.429170.2000.4522.260180.2100.5102.429由表1可以看出，6、14、16号菌株所产的透明圈较大，但由于即使同一个平皿上长出的菌落，其大小也不一，细胞生物量也有所不同，透明圈的大小并不能反映菌株产酶的比活性，因此分别测定它们的菌落直径，但发现这18株菌株的HC值（DH / DC）也相差不大。为了客观地反映菌体的生长和产酶能力，将

18、此18株菌株进行进一步的筛选。2.1.2 菌株的复筛利用平板初筛只能定性地挑选出产酶菌株，而以摇瓶培养形式进行的复筛则可以定量地比较各菌株产酶活力及其菌体生长情况。复筛培养基仍以琼胶作为唯一碳源，培养48 h后分别测定发酵液的琼胶酶活力和菌体浓度。结果见表2。表2 复筛各菌株产酶活力的比较Tab. 2 Comparision of agarase activity produced by different strainsStrainsEnzyme activity /UConcentration of strains (OD620)19.381.96424.251.08639.201.612

19、45.090.81354.430.719612.091.19075.091.44483.591.46994.900.618105.461.572116.020.807123.870.693135.091.134144.811.534156.580.7621611.250.285175.271.012186.581.639由表2可见，6和16号菌株的酶活较高，分别为12.09 U和11.25 U，选前者作为高产菌株，编号为HS0326-6。在此值得一提的是，16号菌株的透明圈直径为2.016 cm，其HC值为2.429 cm，而6号菌株透明圈和HC值各为1.018 cm和1.943 cm。可见1

20、6号菌株的透明圈和HC值均比6号大，而前者的酶活却不如后者，其他菌株的情况也与此类似，这就说明在评价菌株产酶活性高低时，应以摇瓶复筛数据为准，而初筛中透明圈和HC值的大小仅作参考。这与汤海青9指出的“透明圈的大小与菌株产酶活性的高低有一定正相关”并不一致。关于透明圈和酶活之间的关系，有待进一步研究。2.1.3 菌种纯化从自然环境中的微生物样品，经过一次分离形成单菌落，转接斜面培养得到的菌株，因脱离了自然环境条件，在传代培养中细胞发生性状衰退的频率增加，直接使用往往存在酶活急剧下降，甚至丧失酶活，需要经过多次纯化培养才能达到稳定的遗传。实验对复筛得到的高产琼胶降解菌株HS0326-6进行试管斜面

21、活化和平板再次纯化，以筛选出产酶活力较高且稳定的菌株。经过纯化培养，得到高产菌株HS0326-601，其酶活为20.78 U，较纯化前提高了72 %，且酶活稳定。2.2 菌株HS0326-601的初步鉴定菌株HS0326-601在分离培养基平板上培养，3-4 d天可以形成菌落，菌落大小中等。菌落形态特征为：菌落呈圆形，淡黄色，边缘整齐，表面湿润，中央凹陷，不透明（图2）。斜面培养21 h左右菌苔铺满斜面，菌苔呈淡黄色，厚度中等（图3）。镜检观察菌株的个体形态和革兰氏染色结果表明，菌株HS0326-601为革兰氏阴性细菌，菌体呈短杆状，见图4。图2 琼胶降解菌的平板纯化图Fig. 2 Clone

22、s of agarolytic bacteria in plate cultivation图3 琼胶降解菌的斜面培养Fig. 3 Tube culture of agarolytic bacteria 图4 显微镜观察的菌体（放大1000倍）Fig. 4 The shape of strain observed by microscopy（×1000）3 讨 论3.1 在对紫菜养殖地的海水样、紫菜样及土样进行早期筛选后发现，海水样中筛选到的琼胶降解菌株较多，且产酶活力明显高于后两者。故本实验对海水样进行驯化富集，以期获得更多、产酶活力更高的琼胶降解菌株。3.2 本实验中发现，透明圈和

23、HC值均较大的菌株，其酶活不一定较高，说明在评价菌株产酶活性高低时，我们应以摇瓶复筛数据为准，而初筛中透明圈和HC值的大小仅作参考。3.3 菌株HS0326-601在分离培养基平板上生长较慢，一般需要34 d左右才能长成大小适宜的单菌落。而斜面培养时生长则较快， 培养21 h左右即可长出较厚的菌苔。鉴于该菌株生长速度快，通过对其进一步的诱变和发酵条件优化，有望成为高产琼胶酶产生菌，从而为琼胶酶、琼胶寡糖的深入研究和开发应用奠定基础。此外，实验中还发现此类菌株对环境变化较为敏感，遗传性能不够稳定，多次传代后产酶活力有所下降。因此，在后续实验中，除了对菌种进行保藏之外，还需对菌株进行定期活化。目前

24、正在对此菌株进行进一步的鉴定，同时，为提高其产酶活力，对该菌株的诱变选育和发酵条件优化也正在进行之中。REFERENCES1 WANG J X , MOU H J , JIANG X L . Biological activities of a neutral water-soluble agar polysaccharide prepared by agarase degradationJ. High Tech Lett, 2005, 11(4): 415-420.2 ENOKI T , SAGAWA H , TOMINAGA T , et al. Drugs, foods or drink

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