免疫学实验操作流程

1、免疫学实验操作流程第一次实验 双向免疫扩散试验1、小鼠摘眼球取血，双侧均摘取，(搞眼球者和用Eppendorf管接血者配合好，尽量不要让血液流到管外)。收集血液于Eppendorf管中(1管/鼠)。(小鼠取血前12小时停止给固体食物，多给水)2、待血液凝固后，用牙签剥离血块，将Eppendorf管于37放置半小时后，转入4 冰箱中，直至血清彻底析出(约2小时)。3、在第一个半小时内(37 孵育)，解剖小鼠，观察小鼠免疫器官的状、大小、位置等。 4、在4 的2个小时内，要做两件事情。一是为第二天的ELISA实验做准备，具体是包被的那一步骤；二是双向免疫扩散的实验操作。(1) ELISA的包被AB

2、CD124356781091211包被是将抗原吸附于酶标板的过程。抗原的包被浓度为10ug/ml。48孔酶标板各孔依次加包被液100ul/孔，注意设置空白对照。包被好的酶标板置于4 过夜。 包被说明：设三复孔。A1-A3不包被抗原，C1-C3不包被抗原，它们用于阴性对照。(2) 琼脂双向免疫扩散实验操作步骤 制板 配制1.5%琼脂粉溶液(用生理盐水)，微波炉加热至琼脂成溶胶状态(短间隔多次)，室温自然冷却至50 左右(手摸上去能忍受)将琼脂粉溶液倾倒至载玻片上，待琼脂成凝胶状态后进行下一步。(琼脂凝胶尽可能厚一些)打孔 用打孔器在琼脂上打孔。原液原液1/21/21/8AgAg1/81/41/4

3、为稀释抗体和抗原(倍比稀释)做准备。抗体浓度在做预实验时从原浓度开始稀释至8倍结束共3个梯度。稀释方法：取三个EP管，分别标记为1/2、1/4、1/8。每管先加50ul的生理盐水。取血清50ul，加入标记1/2的EP管内，充分混匀后，用加样器吸出50ul，加入到标记有1/4的EP管内，再充分混匀后，再取出50ul，加入至标记1/8的EP管内，充分混匀。再将各管内的血清加入到对应的孔内，每个对应孔加25ul(见图)。加样结束后将载玻片置于一个湿盒内，置于37 孵箱中过夜。第二次实验 ELISA1、于水池内甩净40孔酶标板孔内的包被缓冲液，倒置于吸水纸上，控干孔内液体。2、封闭：1%牛血清白蛋白(

4、BSA)，200ul/孔。37放置1小时。 3、洗涤：采取步骤1中的方法倾倒封闭液，将洗液(含0.05% Tween-20的PBS)加至满孔，室温放置2分钟，倾倒洗液。重复2-3次。最后一次倾倒洗液要彻底。 4加一抗(待检血清)。血清从1：200起始按倍比稀释至10240倍结束，100ul/孔，同一浓度设三复孔。加完样后盖好酶标板于37孵育1小时。ABCD124356781091211AB两排用于检测不加佐剂组的血清，CD两排用于检测加佐剂组的血清。以不加佐剂组的血清为例，简述待测血清抗体的稀释方法如下：取8个EP管，分别标记为1-8号。向第1号管中加入995ul的PBS，向2-8号管中分别加

5、入500ul的PBS。取待测血清5ul，加入至第1号管内，充分混匀后，吸出500ul加入至第2号管内。再混匀从第2号管内吸出500ul加入至第3号管内。依此类推直至第8号管也混匀为止。加佐剂组的血清也用同样的方法稀释(注意用不同的EP管)。稀释全部完成后，按如下对应的方式加样：不加佐剂组血清：1号：A1-A3；2号：A4-A6；3号：A7-A9；4号：A10-A12；5号：B1-B3；6号：B4-B6；7号：B7-B9；8号：B10-B12。加佐剂组血清：1号：C1-C3；2号：C4-C6；3号：C7-C9；4号：C10-C12；5号：D1-D3；6号：D4-D6；7号：D7-D9；8号：D10-D12。5、洗涤：同步骤3。6、加二抗(酶标抗体)：每孔加100ul，酶标板置于37孵箱中孵育40分钟。7、洗涤：同步骤3。8、加底物：底物要现用现配。所选用底物为邻苯二胺(OPD)，用底物缓冲液(柠檬酸盐缓冲液)配制。每孔中加入100ul