高效微生物絮凝剂产生菌BJ_的筛选鉴定及絮凝特性研究_图文

1、文章编号:1008-1402(200902-0301-05高效微生物絮凝剂产生菌BJ -的筛选鉴定及絮凝特性研究李博,赵敏,彭元举(东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040摘要:从活性污泥中筛选出1株高效微生物絮凝剂产生菌B J -,其絮凝率达87.6%.通过生理生化分析及16S rDNA 序列鉴定该菌株为短芽孢杆菌(B acillus brevis .该菌产絮凝剂的最适碳源和氮源分别为20g L 的葡萄糖和2.0g L 的蛋白胨;适宜的初始pH 和培养温度分别为7.0和30;在培养基中添加0.5g L 的Mg 2+有利于菌体生长,但对絮凝剂合成无影响.对该絮凝剂的特性研究结果表明:菌液投放量3

2、%、pH 值在59、温度为60条件下絮凝效果最好,加入浓度为8%的Ca 2+可显著提高其絮凝活性.实验证明,该菌起絮凝作用的物质存在于发酵液中,主要成分为杂多糖.关键词:微生物絮凝剂;絮凝率;鉴定;培养基优化;絮凝特性中图分类号:Q935文献标识码:A 微生物絮凝剂是微生物产生的一种有絮凝活性的代谢产物,是一类重要天然高分子絮凝剂,其分子量一般高于105,包括糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和DNA 等不同物质,且具有废水脱色的独特效果1-4.微生物絮凝剂不仅具有高效、无毒、无二次污染、使用条件粗放等特点,而且其产生菌来源广泛,种类多,因此是一类极具开发前途的水处理药剂5-7.絮凝剂的研究工作已由

3、提纯、改性,进入到利用生物技术培育、筛选优良菌种,以较低的成本获得高效絮凝剂的研究阶段8-9.本文从活性污泥中筛选获得一株具有较高絮凝活性的菌株B J -,并对其培养条件和絮凝特性进行了研究,以期提高该菌株合成的微生物絮凝剂的能力,开发具有针对性的高效微生物絮凝剂,既能明显提高絮凝效果,还可大大降低絮凝剂投入量,从而降低处理成本.1材料与方法哈尔滨文昌污水处理厂活性污泥200g 放入1000m L 去离子水中,于磁力搅拌器上搅拌10min ,待固体沉淀后,1000r min 离心15min 收集上清(1牛肉膏蛋白胨培养基(g L :牛肉膏3,蛋白胨10,NaCl 5,琼脂20,pH7.0.(2

4、选择培养基(g L :邻苯二甲酸二丁脂(D BP 1.0,K 2HPO 40.6,MgS O 47H 2O 0.6,(NH 42S O 40.12,琼脂15,pH6.8.(1分离与纯化:取0.2m L 样品于牛肉膏蛋白胨固体培养基均匀涂布,再经多次划线分离纯化可获得多个纯菌株.(2初筛和复筛:将纯化后的菌种接种到50m L 基础发酵培养基,在35,160r min 条件下振荡培养72h.取2m L 发酵液、0.2g 高岭土、1m L 1%CaCl 2水溶液,加水至50m L ,于磁力搅拌器上搅拌2min 搅拌,静置观察,选择能产生絮状沉淀并收稿日期:2008-12-10作者简介:李博(1983

5、-,女,黑龙江哈尔滨人,东北林业大学生命科学学院,硕士研究生.第27卷第2期佳木斯大学学报(自然科学版V ol.27N o.22009年03月Journal of Jiamusi University (Natural Science Edition Mar.2009使悬浊液变清的菌株的发酵液进行下一步复筛.复筛结果以絮凝率作为表征参数,以蒸馏水代替发酵液作对照,絮凝率计算公式如下:絮凝率=(A -B A ×100%(1细菌的培养形态及生理生化试验细菌的培养形态及生理生化试验参照文献10.(2细菌DNA 的提取及PCR 扩增按传统方法提取细菌基因组DNA 11.选择16S rDNA

6、基因通用引物序列分别为:(5-C AG ATGGG AG CTT 2G CT CCCTG -3;5-CG ACTT C ACCCC AAT C AT CTG-3.PCR 反应条件为:94预变性5min ,94变性30s ,52退火30s ,72延伸1min ,30个循环.絮凝活性的分布参照文献12.分别改变发酵液投加量、pH 值、温度和Ca 2+根据文献13对微生物絮凝剂进行提取和精制.再分别应用紫外分光光度计(T U -1901在200nm 350nm 范围,以及傅里叶变换红外光谱仪(FTIR -8400S 光谱仪在4000500(cm -1范围内对絮凝剂精品进行扫描,分析其主要成分.2结果

7、与讨论2.1菌种筛选及鉴定共筛选获得纯培养45个菌株,选取一株絮凝活性稳定并且絮凝率高达87.6%的菌株进行后续试验研究,命名为B J -.菌株B J -呈杆状,单个或成短链排列,革兰氏阳性菌,有椭圆型芽孢.菌落扁平、光滑、呈乳白色.其生理生化特征见表1.获得菌株B J -16S rDNA 扩增片段1559bp ,测序结果表明该序列与短芽孢杆菌的16S rDNA 序列有较高的同源性为99.3%,结合形态学和生理生化特征鉴定其为短芽孢杆菌属(B acillusbrevis .表1菌株B J -生理生化特征试验项目结果试验项目结果革兰氏染色+葡萄糖产气-氧化酶-醋酸盐利用+接触酶+柠檬酸盐利用+V

8、 -P-硝酸盐利用-乳糖产酸+山梨醇产酸+甲基红-甘露醇产酸+淀粉水解+明胶水解+“+”表示阳性,“-”表示阴性2.2菌株产生絮凝剂的培养条件优化剂的影响分别以葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、乙醇、牛肉膏和甘油作为碳源,试验结果如下:从菌体生长来看,葡萄糖最容易被利用,而在乙醇、牛肉膏和甘油为碳源时基本不生长;从絮凝活性来看,葡萄糖和蔗糖为碳源时菌株B J -絮凝率最高,分别达到86.7%和84.0%;而葡萄糖又是比较廉价易得的原料,所以选用葡萄糖.不同碳源浓度下试验结果见图1.当葡萄糖浓度在1525g L 时,絮凝率最高,当浓度继续增加,絮凝活性出现下降的趋势.从菌体生长来看,以20g L

9、的葡萄糖作为碳源时菌体浓度最高,过高或过低的糖浓度都不利于B J -生长,这是由于糖浓度过低不能提供足够的能量和物质来源,而糖浓度过高会引起发酵液中渗透压过高,使细胞失水生长受到抑制.考虑到成本因素,选择最优碳源浓度为20g L 的葡萄糖.图1碳源浓度对菌株B J -生长及絮凝活性的影响的影响203佳木斯大学学报(自然科学版2009年分别以蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、大豆饼粉、尿素、K NO 3和(NH 42S O 4作为氮源,试验结果表明:细菌B J -在尿素、K NO 3和(NH 42S O 4三种无机氮源中无法正常生长,而在有机氮源中生长状况差别不大,其中以蛋白胨为氮源时菌株同时具有最高的

10、菌体浓度和高达90.2%的絮凝率,所以选择蛋白胨为最佳氮源. L.图2氮源浓度对菌株B J -生长及絮凝活性的影响分别在培养基中加入0.5g L 不同金属离子,试验结果见表2.金属离子对絮凝活性的影响不大,但Mg2+,Ca2+,Na+,Fe 2+和K +对B J -生长有较强的促进作用,而A13+作为培养基组分.表2金属离子对菌株B J -生长及絮凝活性的影响金属离子菌体浓度(OD 600絮凝率(%2+0.5577.2该菌生长最适pH 值在7.5左右,过高或过低均不利于菌株生长,这是由于pH 值过低或过高都会引起微生物表面电荷的改变,从而不利于细胞对营养物质的吸收14.对于絮凝剂的产生,最适p

11、H值为6.0,此时絮凝率高达90%,这是由于该菌产物略呈酸性 .图3初始pH 对菌株B J -生长及絮凝活性的影响在2030范围内,随着培养温度的上升,菌株B J -的生长量和絮凝率都逐渐增加,而在30条件下,生物量和絮凝率均达到最大值,当温度继续升高时,生物量和絮凝率又同时呈逐渐下降的趋势 .图4培养温度对菌株B J -生长及絮凝活性的影响2.3微生物絮凝剂絮凝特性的研究2.3.1絮凝活性的分布将菌株B J -在最适条件下160r min 振荡培共设5个絮凝剂投加量梯度:1m L ,2m L ,3m L ,4m L 和5m L ,与其相对应的絮凝率分别为67.4%,77.9%,83.9%,7

12、4.2%和56.5%.由此可见,在低浓度范围内随着絮凝剂浓度的提高,絮凝率随之提高;但达到一定值后再增加絮凝剂的浓度,所形成的絮凝体会重新变成稳定的胶体,絮凝率反而303第2期李博,等:高效微生物絮凝剂产生菌B J -的筛选鉴定及絮凝特性研究分别测定2m L发酵液对pH值为3,4,5,6,7, 8,9和10的100m L高岭土悬浊液的絮凝率,对应结果为69.5%,73.3%,78.7%,84.8%,84.2%, 82.9%,77.7%和70.0%.试验结果显示,pH在5 9的范围内,絮凝剂的絮凝效果都比较理想,可知该絮凝剂属于非离子型絮凝剂,在酸碱情况下均能保持较好的絮凝效果,利于该菌株合成的

13、微生物絮凝剂的推广和应用.设10个温度梯度:10,20,30,40,50,60,70,80, 90和100(、考察该絮凝剂的热稳定性.结果表明,菌株B J-所合成的絮凝剂在1060范围内随着温度的升高絮凝活性逐渐增大,在3060范围内絮凝活性基本保持不变,以60为最佳条件.但当温度超过60后,絮凝活性开始迅速下降,高岭土悬浊液出现浑浊现象.2.4絮凝剂有效成分的提取及鉴定应用干燥提取得到的絮凝剂粗品处理高岭土悬浊液,絮凝率达89.9%.将此絮凝剂粗品进行层析,选择波长490nm比色,结果如图5所示:第3 10管出现主吸收峰,第3035管出现弱吸收峰.分别将310管、3035管分别进行混合,前者

14、絮凝活性达92.6%,而后者基本没絮凝活性,因此可确定有效成分得到充分分离.最后将第310洗脱液混合后真空冷冻干燥,得到白色粉末即絮凝剂精制品,将此絮凝剂精品处理同样高岭土悬浊液,絮凝率为81.7%,其絮凝活性低于絮凝剂粗品,因此絮凝剂粗品具有实际应用价值 .图5絮凝剂有效成分的硅胶柱层析图谱分析絮凝剂精制品表征结果如下:该絮凝剂精品在205nm处出现唯一的强吸收峰,Amax絮凝剂精品经红外扫描结果如图6所示, 3230,1640,1440和1040cm-1处的吸收峰是所有已知多糖类的特征峰.其中,3230cm-1是-OH伸缩振动的特征峰;1640cm-1和1440cm-1吸收峰分别是-C-O

15、-O非对称伸缩振动和对称伸缩振动引起的结果,表明有羧酸根离子存在;1040cm-1处是C-O-C和C-O-H两种C-O的伸缩振动引起的吸收峰.综上,精制絮凝剂的有效成份为酸性多糖,其表面活性基团有大量的-OH,-C OO-1,该絮凝剂为阴离子絮凝剂 .图6絮凝剂精品红外扫描图谱3结论30、pH7.0,葡萄糖为20gL、蛋白胨为2.0gL,并添加0.5gL Mg2+的条件下生长良好.对影响絮凝作用的各种因素系统分析的结果表明:菌液投放量为3%,pH控制在59、温度为60条件下絮凝效果最好,加入浓度为8%的Ca2+可显著提高其絮凝活性.其后又对该菌株的发酵液分别进行了乙醇粗提和柱层析精提,得到微生

16、物絮凝剂粗品和403佳木斯大学学报(自然科学版2009年精制絮凝剂.研究表明絮凝剂粗品有实际应用价值,对高岭土悬浊液的絮凝率高达92.6%.通过对精制絮凝剂进行了结构分析,发现该絮凝剂的有效成分为酸性多糖,且为阴离子絮凝剂.由此可见菌株B J -所合成的微生物絮凝剂具有絮凝率高、使用条件粗放的特点,所以具有一定的实际应用价值与发展前景.参考文献:1辛宝平,庄源益,李彤.生物絮凝剂的研究和应用J .环境科学,1998,6(5:57-62.2李和平,郑泽根,朱柱,等.微生物絮凝剂J .重庆环境科学,2000,1-21.3吴键,戴桂馥.微生物细胞的絮凝与微生物絮凝剂J .环境污染与防治,1994,1

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20、 -with a high capability of producing bio -flocculant was is olated from activated sludge of Sequencing Batch Reactor.Its flocculating efficiency could achieve 87.6%.The strain was identified as Ba 2cillus brevis based on its m orphological ,physio logical properties and 16S rDNA sequence analysis.This study showed that the optimum pH and tem per ature