贯叶连翘提取物对百草枯诱导肺纤维化保护作用的实验研究

1、贯叶连翘提取物对百草枯诱导肺纤维化保护作用的实验研究何斌,杜晓冬,曹钰*(四川大学华西医院急诊科,四川成都610041)摘要:目的:探讨贯叶连翘提取物对百草枯诱导的大鼠肺纤维化模型的干预作用及机制。方法:20只Spraguedawly大鼠随机等分为4组:百草枯组,贯叶连翘提取物组,百草枯+贯叶连翘提取物组和对照组。百草枯液按80mg/kg一次性灌胃，贯叶连翘提取物按400mg/kg灌胃，连用3d,对照组仅用生理盐水。于21d处死后取肺脏行HE染色鉴定,并用碱水解法测羟脯氨酸含量,同时以八木国夫荧光法测定肺组织脂质过氧化产物,盐酸羟胺法测定组织总超氧化物歧化酶的酶活力。结果:百草枯染毒动物可致肺

2、纤维化,羟脯氨酸和丙二醛含量明显增高。百草枯+贯叶连翘提取物组与百草枯组比较,第21天时肺纤维化减轻,羟脯氨酸和丙二醛含量减少(P005)。结论:贯叶连翘提取物对百草枯诱导的大鼠肺纤维化模型有抑制作用,其机制可能与抑制脂质过氧化有关。关键词:肺纤维化;贯叶连翘提取物;百草枯中图分类号R282.71;R595.4文献标志码A文章编号1002-0179(2009)06-1473-03Effects of Hypericum Perforatum L on Paraquatinduced Pulmonary Fibrosis in RatsHE BIN, DU XIAOdong, CAO Yu. t

3、he Department of Emergency, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, ChinaCorresponding author: CAO Yu. Email: Abstract: Objective: To investigate the effects of Hypericum perforatum L on paraquatinduced pulmonary fibrosis in rats and its possible mechanism. Methods: Twenty male Spra

4、guedawly rats were used in the experiments (weighing 190 230g) . The animals were randomized into 4 groups: group PQ (paraquat was given at the dose of 80mg/kg by stomach perfusion), group HP (Hyericum perforatum L at the dose of 400mg/kg by stomach perfusion), group HP+PQ (Hyericum perforatum L bef

5、ore paraquat at the dose of 80mg/kg by stomach perfusion), and normal control group (equivalent volume of normal saline). Twentyone days after treatment, the animals were killed. The pathological model was evaluated by HE and the hydroxyproline of lung tissue was determined. At the same time, malona

6、ldehyde content and superoxide dismutase (SOD) activity were determined in the lung tissues. Results: Paraquat caused a significant increase in the contents of hydroxyproline and malonaldehyde and Hypericum perforatum L significantly decreased the amount of hydroxyproline and malonaldehyde (P005). C

7、onclusion: The pulmonary fibrosis induced by paraquat can be inhibited by Hypericum perforatum L. The inhibitory effect of Hypericum perforatum L may be ascribed to the reduction of MDA partly.Key words: pulmonary fibrosis; Hypericum perforatum L; paraquat百草枯(paraquat,PQ)中毒患者急性期后多出现不可逆的肺纤维化(pulmonar

8、y fibrosis,PF),病死率高。其发病机制不明,与组织细胞的氧化性损害有关,目前尚无特殊治疗。贯叶连翘(Hypericum perforatum)提取物具有清除自由基和抗氧化的作用1,本研究旨在探讨贯叶连翘提取物对PQ诱导肺纤维化保护作用,进一步为贯叶连翘治疗PQ中毒肺纤维化提供理论依据。1材料与方法11材料:体积分数为20% PQ溶液(河北桃园农药有限公司);脂质过氧化产物丙二醛(malonaldehyde,MDA)试剂盒(南京建成);羟脯氨酸试剂盒(南京建成);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒(南京建成);贯叶连翘提取物(成都川大华西康达药物

9、研究所);台式高速离心机(德国Heraeus);紫外分光光度计(Beckman公司);Imagproplus图像分析系统(美国Media Cybernetics公司)。SPF级Spraguedawly大鼠20只,雄性,体重190230g,购自四川大学实验动物中心。12方法121制备模型2:禁食12h后,一次性灌胃PQ液80mg/kg后正常进食、饮水。于第21d处死各组动物,称重后开胸取左上肺小块肺组织,10%福尔马林溶液内浸泡固定后石蜡包埋,切成5m厚的切片,HE染色行光镜检查。122动物分组:将Spraguedawly大鼠20只随机分为4组,每组5只。PQ组:一次性灌胃PQ液80mg/kg;

10、贯叶连翘提取物组(HP组):贯叶连翘提取物(400mg/kg)灌胃,每天一次,连续3d后予09%生理盐水(NS)灌胃;HP+PQ组:贯叶连翘提取物(400mg/kg)灌胃每天一次,连续3d后予PQ液80mg/kg灌胃;对照组:09% NS灌胃每天一次,连续4d。123检测指标:将肺组织样品剪碎,用碱水解法测定羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp);剪取左肺,按15加入生理盐水制备匀浆,3000r/min离心10min,取上清分别以八木国夫荧光法测定肺组织MDA和盐酸羟胺法测定组织总SOD的酶活力。124图像分析:照像后采用Imagproplus图像分析系统,半定量测定阳性反应物平均光

11、密度(mean optical density,MOD)以及阳性细胞在参照系中所占相对面积。125统计学方法:计量资料数据以均数标准差(AKx-s)表示,采用SPSS130软件,组间差异比较采用单因素的方差分析(Oneway ANOVA),两两比较采用LSDt检验。P005有显著性差异。2结果21大鼠一般状况观察:正常对照组及HP组大鼠活泼好动,强壮肥硕,PQ组及PQ+HP组均表现不同程度的眯眼、呆滞、拱背、毛枯,攻击性降低,活动少,鼠毛蓬松等现象,PQ+HP组上述表现明显减轻,没有观察到鼠尾发绀现象。22肺组织病理改变221大体组织观察:正常对照组及HP组肺组织色泽红润,质软,弹性好,表面光

12、滑。PQ组双肺呈灰白色,表面凹凸不平,硬度增加,体积缩小,表面有条索样凹沟。PQ+HP组肺组织变化与PQ组相比较,损伤范围较小,纤维结节灶数量较少,韧度较轻。222光镜观察:对照组及HP组未出现明显病理改变。PQ组及PQ+HP组均有不同程度的较大范围的慢性炎性灶。在肺实质有较大范围纤维增生,局部有纤维化倾向。肺组织部分实变,部分肺泡腔消失,为大量胶原纤维、成纤维细胞、淋巴细胞所占据,支气管扩张,肺泡上皮增生,间质增厚。上述改变以PQ组更为明显,PQ+HP较轻。23肺脏Hyp、MDA含量、SOD活力变化:由表1可以看出,PQ组肺组织Hyp、MDA含量高于对照组,有统计学差异(P005)。经贯叶连

13、翘提取物预处理后肺组织Hyp、MDA含量明显降低(P005)。3讨论PQ商品名为克无踪,属有机杂环类,作为除草剂被广泛应用。临床上中毒患者日趋增多,病死率高。机体染毒后肺是PQ作用的主要靶器官,所致肺损伤分为早期急性肺泡炎和后期的肺间质纤维化两个阶段。病理检查发现大量肺泡结构中广泛分布着许多增殖的成纤维细胞和肌成纤维细胞,胶原蛋白和其他结缔组织成分增多,肺泡壁破坏3。PQ是一电子受体,作用于细胞内的氧化还原反应,生成大量活性氧自由基,引起细胞膜脂质过氧化,造成组织细胞的氧化性损害。7OOH与7OOH、氧化甾醇、氧化胆固醇常作为脂质过氧化的指示剂被用于鉴别是否存在脂质的氧化。Adachi等发现大

14、鼠PQ中毒时,肺脏组织7及7羟基胆固醇25,3醇(7OOH与7OOH)以及7及7羟基胆甾醇(7OH与7OH)与7酮胆固醇(7keto)显著增加4。脂质过氧化物(LPO)是自由基作用于多不饱和脂肪酸的产物,其含量与自由基的浓度成正比。脂质过氧化物在稀酸中加热降解为MDA,MDA可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合,形成红色产物,该产物在532nm处有最大吸收峰。本试验采用的MDA试剂盒可以准确地反映出细胞水平的脂质过氧化量5。实验结果证实PQ染毒动物肺组织MDA明显增高,存在细胞脂质过氧化过程。这个过程与自由基引发的组织损伤相关,因此,抑制自由基的产生,减轻细胞脂质过氧化是防治肺纤维化的重要策略。贯叶

15、连翘提取物是一种组成复杂的混合物,其中较为重要的化学成分主要有三类:萘骈二蒽酮化合物(naphthodianthrones)、间苯三酚化合物(phloroglucinols)和黄酮类化合物(flavonoids)。黄酮类化合物可以抑制组织中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSHPx)活性的降低,减少组织脂质过氧化产物MDA和NO含量。贯叶连翘提取物中的槲皮素(queretin)、芦丁(rutin)、金丝桃苷(hyperoside)、金丝桃素(hypericin)、穗花杉双黄酮(ament

16、oflavone)等成分均单独具有抗氧化活性6。对贯叶连翘提取物的研究集中在抗抑郁及抗肿瘤等方面,其抗纤维化作用鲜有研究。临床上以口服PQ中毒多见,因此本研究利用一次性灌胃PQ造模。通过大体组织观察以及光镜观察均发现纤维灶的形成,说明造模成功。Hyp是机体胶原蛋白的主要成分之一,约占其氨基酸总量的13,其它除弹性蛋白含有少量Hyp外,均不含Hyp。因此组织中Hyp含量可作为其胶原组织代谢的重要指标。实验结果发现PQ染毒动物肺组织中Hyp含量显著增加,证实了PQ对动物的致肺纤维化作用。使用贯叶连翘提取物后第21天肺纤维化明显减轻,Hyp及MDA含量减少,提示贯叶连翘提取物可通过抑制脂质过氧化程度

17、减轻PQ诱发的大鼠肺纤维化。SOD活力间接反应了机体清除氧自由基的能力,它分布于细胞表面及胞外基质中,对于保护肺泡细胞及抑制基质的过度重建有重要作用7。本实验中,PQ中毒组的SOD活力增加,经贯叶连翘提取物预处理后SOD活力进一步增加,但均没有统计学上意义,推测在成纤维细胞过度增殖并分泌大量胶原的过程中,SOD可能代偿性发挥一定的抑制作用。综上,本研究采用贯叶连翘提取物预先给药,能减轻PQ染毒动物肺纤维化程度,其机制可能与抑制脂质过氧化有关。4参考文献1魏薇,何庆.贯叶连翘提取物对百草枯所致的急性肺微血管内皮细胞损伤的保护作用J.四川大学学报(医学版),2006,37(3):4344372高燕

18、,雍政,黄英,等.百草枯建立肺纤维化动物模型的实验研究J.空军总医院学报,2003,19(4):2012023ORITO K, SUZUKI Y, MATSUDA H, et al. Chymase is activated in the pulmonary inflammation and fibrosis induced by paraquat in hamstersJ. Tohoku J Exp Med,2004,203(4):2872944ADACHI J, ISHII K, TOMITA M, et al. Consecutive administration of paraquat to rats induc