高效液相色谱法测定乳制品中的三聚氰胺

1、2010级化学教育仪器化学综合性与设计性实验高效液相色谱法测定乳制品中三聚氰胺的含量 2012-06-03一、实验题目：乳制品中三聚氰胺的含量的测定（高效液相色谱法）二、摘要、关键词：摘要 三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物,被用作化工原料。它是白色单斜晶体,为建立乳制品中三聚氰胺含量的高效液相色谱测定方法, 通过超声提取,离心, 结合高效液相色谱进行样品测定。A液：0.9508 g辛烷磺酸钠（5mmol/L）+ 1.0640 g柠檬酸（pH=3-4）用高纯水品配制1L溶液；B液：甲醇；色谱条件：30%B+70%A。 色谱柱：CNWSIL C18液相色谱柱（4.6×250mm，5

2、 µm）,检测波长：240nm。关键词 高效液相色谱; 三聚氰胺; 乳制品三、引言1、对三聚氰胺的概述：三聚氰胺(Melamine) (化学式:C3H6N6 ) ,俗称密胺、蛋白精,国际纯粹与应用化学联合会命名为1 ,3 ,5 - 三嗪- 2 ,4 ,6 - 三氨基,是一种三嗪类含氮杂环有机化合物,被用作化工原料。它是白色单斜晶体,几乎无味,微溶于水(311g/PL常温) ,可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等,对身体有害,不可用于食品加工或食品添加物。三聚氰胺的结构式如下：三聚氰胺最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲 醛树脂(MF) 的原料。三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲

3、醛清洁剂等。该树脂硬度比脲醛树脂 高, 不易燃,耐水、耐热、耐老化、耐电弧、耐化学腐蚀,有良好的绝缘性能、光泽度和机械强度,广泛运用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。蛋白质主要由氨基酸组成。蛋白质平均含氮量为16 %左右,而三聚氰胺的含氮量为66 %左右。通用的蛋白质测试方法“凯氏定氮法”是通过检测含氮量来估算蛋白质含量,因此,添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量偏高,从而使劣质食品通过食品检验机构的测试。三聚氰胺常被不法商人添加到食品中,以提升食品检测中的蛋白质含量指标,因此三聚氰胺也被人称为“蛋白精”。2007 年“出口宠物饲料事件”后,我国全面开展了该物质的检测技

4、术研究, 其中比较主要的方法有高效液相色谱法(HPLC) 1 、液相色谱- 质谱P质谱联用法(LC - MSPMS) 2 、气相色谱- 质谱联用法(GC - MS) 3 ,但检测方法主要针对宠物食品等,本方法在参考美国食品化学品法典(Food Chemicals Codex, FCC) 检测方法的基础上,筛选了适用的快速前处理方法,建立了乳与乳制品中三聚氰胺的高效液相色谱测定方法,该方法样品前处理简单,易操作,能够满足质量监督和卫生部门的检验需求。2、对三聚氰胺的测定方法概述：国家质量监督检验检疫总局与标准化管理委员会联合发布了原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法，即国标GB/T22388-200

5、8。这一新标准制定了高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法及气相色谱-质谱联用法三种检测方法与标准。三聚氰胺的检测方法还包括试剂盒检测法（ELISA）、离子交换色谱-紫外检测法等。2.1高效液相色谱法（HPLC)：试样中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，提取液离心后经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，洗脱物吹干后用甲醇溶液溶解，用高效液相色谱仪进行测定。在添加浓度2mg/kg10mg/kg浓度范围内，回收率在80%110%之间，相对标准偏差小于10%。2.2气相色谱-质谱联用法（GC-MS和GC-MS/MS）：试样经超声提取、固相萃取净化后，进行硅烷化衍生，衍生产物采用选择离子监测质谱扫描模式（SI

6、M）或多反应监测质谱扫描模式（MRM），用化合物的保留时间和质谱碎片的丰度比定性，外标法定量。其中GC-MS法在添加浓度0.05mg/kg2mg/kg浓度范围内，回收率在70%110%之间，相对标准偏差小于10%；GC-MS/MS法在添加浓度0.005mg/kg1mg/kg浓度范围内，回收率在90%105%之间，相对标准偏差小于10%。2.3液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）：试样用三氯乙酸溶液提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，外标法定量。在添加浓度0.01mg/kg0.5mg/kg浓度范围内，回收率在80%110%之间，相对标准偏差小于10%。2

7、.4试剂盒检测法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA）：试剂盒检测法即为酶联免疫吸附剂测定，是利用萃取液通过均质及震荡的方式提取样品中的三聚氰胺进行免疫测定的一种方法。2.5离子交换色谱-紫外检测法：何强建立离子交换色谱-紫外检测法测定乳制品中三聚氰胺。样品用水和乙腈提取，分析时用LC-SCX离子交换色谱柱分离，浓度为0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（pH3.0）-乙腈（70：30）为流动相，在紫外波长240nm处检测。三聚氰胺为0.5mg/L-100.0mg/L时，质量浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系（r=0.9999），最低检出限为1.0mg/k

8、g，加标回收率为93.8%102.5%，RSD<3.5%。2.6其他检测法：利用抗原与抗体相互识别的原理，制作出能识别三聚氰胺的抗体试纸，将试纸插入稀释的奶制品中，则可检测出其中是否含有三聚氰胺。使用膜分离技术萃取样品溶液，然后采用紫外可见光度法或化学检验的方法检测样品中三聚氰胺的含量。3、选定实验方案的原理：试样分别用纯三氯乙酸溶液、三氯乙酸-乙腈溶液和三氯乙酸-硫酸铅溶液提取，试样经溶解、超声提取、沉淀蛋白、过滤得到测试液之后再经高效液相色谱测定，根据保留时间和紫外吸收光谱定性，根据峰面积进行定量。四、实验部分高效液相色谱法（HPLC）1、试剂与材料（除非另有说明，所有试剂均为分析纯

9、。）1.1 甲醇：色谱纯。1.2 乙腈：色谱纯。1.3 氨水：含量为20%。1.4 硫酸铅1.5 冰乙酸1.6 柠檬酸。1.7 辛烷磺酸钠：色谱纯。1.8 三氯乙酸溶液（1）：准确称取2.5g三氯乙酸用水溶解后转移至250mL容量瓶中，定容至刻度，混匀后备用。1.9 离子对试剂缓冲液：准确称取0.9508 g 辛烷磺酸钠（5mmol/L）+ 1.0640 g柠檬酸（pH=3-4）用高纯水品配制1L 溶液，备用。1.10 三聚氰胺标准品：CAS 108-78-01，纯度大于99.0%。1.11 三聚氰胺标准储备液：准确称取0.2500g（精确到0.1 mg）三聚氰胺标准品于100mL 容量瓶中，

10、用甲醇水溶液（20%）溶解并定容至刻度，配制成浓度为2.5 mg/mL的标准储备液，于4避光保存。2、仪器和设备2.1 高效液相色谱（HPLC）仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。2.2 分析天平：感量为0.0001 g。2.3 离心机：转速不低于4000 r/min。2.4 超声波水浴。2.5 具塞塑料离心管：50mL。3、样品处理3.1 提取：分别称取3份5 g（精确至0.0001g）伊利学生奶粉于50mL具塞塑料离心管中，各加入5mL配制好的2.5g/L的三聚氰胺溶液，编号1、2、3，往1号试管中加入20mL三氯乙酸溶液，往2号试管中加入15mL三氯乙酸和5mL乙腈溶液，往3号试管中加

11、入15mL三氯乙酸和5mL硫酸铅乙酸溶液，超声提取10 min，后以4000 r/min离心10 min。取上清液10mL于25mL容量瓶中用水定容，待测。4、高效液相色谱测定4.1 HPLC条件a) 色谱柱：CNWSIL C18液相色谱柱 （4.6×250mm，5 µm）b) 流动相：A液：0.9508 g 辛烷磺酸钠（5mmol/L）+ 1.0640 g柠檬酸（pH=3-4）用高纯水品配制1L溶液；B液：甲醇；色谱条件：30%B+70%A。c) 流速：1.0mL/min。d) 柱温：40。e) 波长：240 nm。f) 进样量：2L。4.2 标准曲线的绘制配制一系列标准

12、溶液，浓度分别为：0.01 mg/ml、0.02 mg/ml、0.05 mg/ml、0.10 mg/ml、0.25 mg/ml、0.58 mg/ml、1.00 mg/ml，浓度由低 到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。 4.3 定量测定待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。4.4 结果计算试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件处理得出。五、结果与讨论 1、定性：由上图得出：三聚氰胺保留时间为：15.866 min。 2、定量： 2.1、标准曲线的绘制： 进样量：每次2µl。0.000.250.500.75浓度0.01.

13、02.03.04.0面积(x1,000,000)Y = aX + ba = 4495951b = 18978.83R2 = 0.9999387R = 0.9999693 2.2、三氯乙酸：由软件计算得：三聚氰胺的浓度=0.107 mg/ml2.3、三氯乙酸+乙腈：由软件计算得：三聚氰胺的浓度=0.134 mg/ml2.4、三氯乙酸+硫酸铅乙酸溶液：由软件计算得：三聚氰胺的浓度=0.107 mg/ml结论：由三氯乙酸+乙腈组成的提取剂比纯三氯乙酸和三氯乙酸+硫酸铅乙酸溶液组成的提取剂效率高。若忽略奶粉中原来的三聚氰胺，且提取过程无损失，则最终待测液中的三聚氰胺浓度为：×10mL2.5m

14、g/mL×5mL= 0.1mg/mL 50mL 25mL 则: 纯三氯乙酸的提取效率为：0.107/0.1=107% 三氯乙酸+乙腈的提取效率为：0.134/0.1=134% 三氯乙酸+硫酸铅乙酸溶液的提取效率为：0.107/0.1=107%一、可以发现三者所得的提取效率均大于1，其可能原因如下： 1、伊利奶粉本身含有部分三聚氰胺。 2、先加了提取剂再加入三聚氰胺导致三聚氰胺直接与溶剂相溶而并未与奶粉混溶，相当于将三聚氰胺全量从奶粉中提取了出来。 3、进样>2µl。 二、三氯乙酸+乙腈组成的提取剂提取率最高，三氯乙酸、乙腈和铅离子都是沉淀蛋白的试剂，三氯乙酸能使蛋白质

15、分子的肽链断裂，破坏蛋白质分子的结构使其沉淀，但对于大分子的蛋白质，其结构复杂性与致密性大，三氯乙酸可能渗入分子内部而使之较难被完全除去，需使用乙腈这种有机溶剂抽提三氯乙酸而更好的沉淀蛋白，铅离子是重金属离子，使蛋白质变性成为固体沉淀下来，效果不如三氯乙酸好。因此，三氯乙酸+乙腈提取剂是最好的选择，其比例还有待进一步研究。六、参考文献 1 GBPT 5009 2003. 食品卫生理化检验方法理化部分 S . 2 钱中兵. 三鹿婴幼儿奶粉受三聚氰胺污染 EB /OL . 2008209211 . http: / /news. xinhuanet. com /newscenter/2008209

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