形态学基本技术

1、形态学基本技术一取材（1）动物材料尽量活杀，在处死半小时内取材完毕；（2）勿挤压组织，刀剪应锋利，动作迅速准确，勿“拉锯”；（3）正常组织或器官在特定部位取材，病变组织或器官在病变与正常区域或典型的区域取材；（4）可略加固定后修快；（5）微小的组织用擦镜纸或吸水薄纸包好。二固定固定的目的：（1）破坏细胞内的溶酶体酶。组织离体后，失去氧的供应，细胞就死亡并释放出溶酶体酶把细胞溶解，称为组织自溶。因此，组织固定的目的首先是立即杀死细胞并将溶酶体酶固定及膜性结构固定，防止细胞的自溶。（2）杀死外来细菌。离体后的组织即失去活力，如不及时固定，就失去抵抗细菌的能力，在室温下极易使细菌生长繁殖，导致组织的

2、腐败。（3）尽可能保持生活体的原状。如活细胞时的微细结构，核在有丝分裂时的形态，细胞内含物的装置等。都要求通过固定保持细胞原有状态，以利于进行观察研究。（4）凝聚、沉定细胞内原有产物，使不被溶解或消失。细胞是由蛋白质、糖类、脂类、各种无机盐和色素等组成，在固定过程中要尽可能保存各种物质为不溶性。（5）使组织保持一定的硬度和弹性，抵抗以后的脱水、透明、浸蜡等过程不发生较大的扭曲或变形，使各级溶液在组织间隙内自由交换取得良好的制片效果。（6）对组织的分析性染色起媒染作用。（7）有利于区别各种细胞的折光率。固定使不同细胞或细胞内各种物质产生不同折光率，染色后利于识别各型细胞的结构。固定液的使用和配制

3、：固定液常用10福尔马林液（甲醛稀释液）。大组织要切开固定，然后在取材时修切成大小约22×22mm，厚度不超过2mm的组织块进行脱水。 常规固定液的配制10% 福尔马林液浓甲醛  10 ml蒸馏水   90 ml三 . 组织脱水  组织脱水目的：利用某些能与水相混合的化学试剂泡浸组织，把组织内水分逐步置换出来。组织经过水溶性固定液固定和水洗后，其间隙内含有较多水分，因水与二甲苯、石蜡是不能混合的，即使组织间隙内含有极少的水也会阻碍二甲苯和石蜡的渗透，所以未经脱水或脱水不彻底的组织不能直接进入二甲苯透明和石蜡中浸蜡。只有使组织内部水分彻底脱除，才

4、能进行透明、浸蜡、包埋组织蜡块才能长久保存。常用的脱水液为乙醇，用乙醇脱水要由低浓度逐级上行至高浓度（一般70100%的浓度），逐步置换组织内的水份，最后组织内部水分被高浓度乙醇所取代。组织在乙醇脱水时，低浓度乙醇（95%以下）的时间可适当延长，高浓度乙醇（100%）脱水时间不能过长。四.组织透明  组织经脱水后、浸蜡前必须经过某些既能与脱水剂相混合又能溶解石蜡的中间溶剂处理。组织在中间溶剂时，组织间隙内存留的脱水剂完全为中间溶剂所取代时，组织就呈现透明状态，此时即可进行浸蜡。透明液多采用二甲苯，组织经无水乙醇脱水后转入二甲苯透明，组织的大小、厚薄不同，透明时间也不同，一般为3060

5、分钟。五.组织浸蜡   用于浸蜡的石蜡最好是熔点稍低（5658），低温浸蜡对保存组织细胞内的抗原免疫活性，避免组织收缩和变硬变脆有帮助。根据脱水机配有的蜡缸数量，浸蜡采用二级至四级，以尽量清除二甲苯。不同大小和厚薄的组织浸蜡时间有所不同，一般为13小时。浸蜡温度过高，浸蜡时间过长均可导致组织收缩，变硬变脆，难以切出理想切片。六.组织包埋   组织经浸蜡后即可进行包埋。包埋时，包埋石蜡的温度要比组织高（约35），否则包埋冷凝后组织与包埋石蜡分离，特别是在冷天包埋时，动作更要迅速，否则容易导致组织与石蜡融合不好，影响切片。包埋时把组织最大最平切面或所需的病灶

6、切面向下，对皮肤、肠管和囊壁等层次清楚的组织其切面应包含有各层组织。组织包埋完后，蜡块要与取材时记录的组织形状和数量核对，发现问题，及时解决。全自动脱水机组织处理的参考时间实验组织：小鼠肝,脾,肺,心,大脑，胃，肠等固定剂： 10%Hcho固定时间：24小时。脱水步骤步骤 试剂 时间1. 75%ALC 2h或过夜2. 90%ALC 30min3. 95%ALC 30min4. 100%ALC 30min5. 100%ALC 30min6. 100%ALC 30min7. XYL 10min8. XYL 10min9. XYL 10min10. WAX 20min11. WAX 20min12.

7、 WAX 20min13. 包埋七. 组织切片   组织切片厚薄要适宜，薄的切片细胞不会重叠，易于观察。切片的厚度一般为4，要切出薄而平整的切片需要正确使用切片机，切片前要把切片机上有关的各螺旋拧紧，如没有拧紧切片机上有关的各螺旋，保证切片刀锋利和调至合适的角度。组织蜡块过硬，切片刀或蜡块没固定好，会出现跳刀、切片成一截厚一截薄的现象。八. 贴片烤片   切出的蜡片先平放到常温蒸馏水中,然后用载玻片捞起蜡片置恒温水中，根据包埋石蜡的熔点不同，水温约为4050左右。贴片时要注意贴在载玻片中间稍偏右的位置上。对一些组织如皮肤、胃肠等贴片时要注意表皮

8、或粘膜面在下，真皮或肌层在上，方便在镜下观察。贴好片后放入约4555的烤箱内或恒温热板上烤烘2小时以上，使蜡片牢固地粘附在玻片上。烤烘切片的温度一般比包埋石蜡的熔点高5左右。九.切片脱蜡   切片在染色前必须脱蜡干净，脱蜡不干净会影响组织细胞的着染，即使着染，组织和细胞也会模糊不清。脱蜡一般用两级或三级脱蜡剂如二甲苯，时间为1020分钟。如果脱蜡剂使用多次或室温较低，均需延长脱蜡时间。十.水合作用由于二甲苯属于非水性的有机溶剂,与水互不相溶, 乙醇通过“水合”作用逐步去除切片上的二甲苯成分,使水能逐渐融入标本中,为染色作准备。乙醇浓度从高到低。十一苏木素染色原理：细胞核内带

9、负电荷的染色质与带正电荷的苏木精碱性染料结合而被染色，苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。Harris苏木素的配制苏木素（Hematoxylin）C18H14O6（1）液 苏木素 1克 纯酒精 10毫升（2）液 硫酸铝钾 20克蒸馏水 200毫升氧化汞 0。6克冰醋酸 8毫升A.将（1）用玻棒搅拌使苏木精溶解。B.再将（2）加温溶解（7080不必沸腾），即加入溶化的（1）液，继续加温至沸腾狀态（12分钟），移出火面，并在沸腾状下迅速加进氧花汞，将烧杯移入冰水中急冷，并不停摇动，使其完全冷却后，静止过夜，次日再过滤。C. 在过滤后加进冰醋酸 ，即可使用。注意：（1）在加氧化汞时，容器

10、应尽量大，且必须离开火面。（2）染液正常时，细胞核呈棕红色，经分色后呈浅红色，流水冲洗或碱化后呈蓝色。（3）经苏木素染色后，正确的结果应是细胞核呈鲜明的蓝色，背景为无色。十二. 分化  分化是把过染的细胞核部分和不应着染苏木精的细胞浆等组织成分脱色，从而使着染的细胞核与细胞浆及细胞周围的组织成分对比清晰。分化时间的长短视组织的性质，切片的厚薄，苏木精染色的深浅和分化液的新旧来决定，一般是8-10秒钟，若切片不分化或分化不足，组织不仅着染细胞核，也着染细胞浆等其他成分，使组织结构对比不清晰；若分化过度，细胞核过淡或褪色。盐酸乙醇分化后，一般需流水冲冼，避免切片留有盐酸，使细胞

11、核褪色。另一方面苏木精经酸后要经流水冲洗来促兰。流水冲冼一般需30分钟以上。* 盐酸-乙醇分化液的配制  浓盐酸                                1ml  70%乙醇      &

12、#160;                       99ml十三.伊红染色原理：伊红是一种酸性染料，在溶液中离解成带负电荷的阴离子与蛋白质的氨基正电荷结合而使细胞质染色。（1）0.250.5%伊红Y水溶液。伊红Y             

13、0;            0.250.5g蒸馏水                              100ml冰醋酸      &

14、#160;                     13滴（2）0.250.5%伊红Y乙醇溶液。伊红Y                         

15、;    0.250.5g80%乙醇                              100ml 十四. 切片脱水透明   切片经HE染色后，要彻底脱水透明，才能用中性树胶封盖。如果脱水不彻底，封片后呈白色雾状，镜下观察模糊不清，且容易褪色

16、。 十五. 封片   切片染色后封片常用中性树胶，酸性的树胶可使胞核褪色，如树胶放置时间过长，因氧化而变酸。中性树胶可用二甲苯稀释。树胶过浓，封片时容易导致气泡；过稀，封片时易使胶外溢，影响美观，也会出现由于二甲苯挥发后缺胶的现象.十六. 常规HE染色步骤1二甲苯(),15min；2二甲苯(),15min；3100%乙醇(),15min；4100%乙醇(),5min；595%乙醇,5min；690%乙醇,5min；780%乙醇,5min；870%乙醇，5min；9蒸馏水，3min; 10苏木素,5min;11流水,2min;12盐酸酒精,10s;（此步骤较为重要）13流水,50min;14蒸馏水,3min;15伊红,4min;1680%乙醇，2min； 1790%乙醇,2min；1895%乙醇,2min；19100%乙醇(),