乙型肝炎病毒检测试剂盒(原位杂交)

1、乙型肝炎病毒检测试剂盒（原位杂交）（操作之前请详细阅读此说明书） 检测原理和意义原位杂交技术的原理是采用荧光、生物素、地高辛等标记的探针，依据碱基互补配对原理，与组织切片、细胞涂片等标本中的靶序列特异杂交，经信号放大及显色后，镜下观察结果。此方法具有很高的灵敏性和特异性。HBV（乙肝病毒）是引起乙型肝炎的病原体，常可导致肝硬化、肝癌等，危及患者生命。HBV原位杂交检测产品通过HBV探针与病原核酸的特异结合，检测组织中HBV感染的存在。尤其是当组织学上病变轻微不易诊断时，HBV原位检测常可帮助确诊。 试剂盒提供的材料和试剂成 份保存方法提 供 量20人份50人份1HBV 杂交液-20500ul6

2、25ulx22蛋白酶K(10X)-20100ul250ul3过氧化物酶阻断剂41ml2.5ml4蛋白阻断剂41ml2.5ml5一抗41ml2.5ml6二抗41ml2.5ml7HRP聚合物41ml2.5ml8DAB底物41ml2.5ml9DAB 420ul50ul1018X18mm盖玻片4或室温20片50片11湿盒增效液4或室温30ml30ml（注意：HBV杂交液和蛋白酶K请 -20保存。） 用户自备材料和试剂1. 原位杂交加热器（泰普编号：M10061）8. 二甲苯2. 37恒温培养箱9. 酒精3. 光学显微镜10. PBS(pH=7.6)4. 移液器11.苏木素5. 计时器12. 氨水6.

3、玻片染色缸和染色架13. 盐酸酒精7. 湿盒2个 实验前需配试剂30湿盒增效液取湿盒增效液及蒸馏水，按3:7配制成30%湿盒增效液备用。 实验时需配试剂A、1X蛋白酶K工作液取适量10X蛋白酶K ，用蒸馏水稀释10倍（1份10X蛋白酶K加9份蒸馏水），并将此1X蛋白酶K 工作液存放于室温备用。（现配现用）B、DAB显色液依据需要配制DAB显色液，以可覆盖整个组织的量为宜。取DAB与DAB底物，按照1：50的比例混匀，避光保存备用。(现配现用) 操作步骤1切片处理：将4um厚度的组织粘附在APES处理的载玻片上，切片于60-70烘烤60分钟以上。（建议每次实验同时附加阳性、阴性对照片）2脱蜡及水

4、化：溶液次数时间（分）二甲苯3 10100%酒精1 395酒精1 x 380%酒精1 3蒸馏水1 x 3（注意：使用过的二甲苯，应相应延长脱蜡时间，以保证脱蜡完全）3酶消化处理：甩干切片，将组织周围液体用滤纸吸干，每张切片滴加适量蛋白酶K工作液(约50 ul，根据组织大小增、减量)，37孵育30分钟。4封闭内源性过氧化物酶：蒸馏水冲洗，小心擦干组织周围液体，滴加适量过氧化物酶阻断剂(约50 ul，根据组织大小增、减量)，室温水湿盒中孵育10分钟。PBS液洗涤21分钟后，蒸馏水洗涤11分钟，小心擦干组织周围液体。5杂交：5.1 每张切片滴加适量杂交液(约25 ul，根据组织大小增、减量)，并加盖

5、玻片（本试剂盒配备，可根据加入杂交液量进行剪裁）；5.2 放置于95原位杂交加热器上变性5分钟；5.3 放入含30%湿盒增效液的湿盒中，37下孵育4-16 小时。建议过夜（16小时）以保证低拷贝样本的杂交效果；5.4 48（PBS 预温）浸泡切片，小心移去盖玻片，PBS继续浸泡5分钟；5.5 48 PBS洗涤3x 5分钟 (轻微振荡容器)；（注意：盖玻片规格应与杂交液量匹配，切片在整个试验过程中要保持湿润状态，防止干片）6蛋白封闭：小心擦去组织周围液体，滴加适量蛋白阻断剂(约50 ul，根据组织大小增、减量)，室温水湿盒中孵育5分钟；PBS洗涤1x1分钟。7信号放大与显色：7.1 小心擦去组织

6、周围液体，滴加适量一抗(约50 ul，根据组织大小增、减量)，37，水湿盒中孵育30分钟；37PBS浸泡3x2分钟（轻微振荡容器）；7.2 小心擦去组织周围液体，滴加适量二抗(约50 ul，根据组织大小增、减量)，室温，水湿盒中孵育20分钟；室温PBS浸泡3x2分钟 (轻微振荡容器)；7.3 小心擦去组织周围液体，滴加适量HRP聚合物(约50 ul，根据组织大小增、减量)，室温，水湿盒中孵育30分钟；室温PBS浸泡3x2分钟 (轻微振荡容器)。7.4 小心擦去组织周围液体，滴加适量DAB显色液(约50 ul，根据组织大小增、减量)，室温，水湿盒中孵育约10分钟。（不同样本的显色时间可能有所差别

7、，建议镜下观察显色过程）；室温PBS浸泡3x2分钟 (轻微振荡容器)。7.5 自来水冲洗，苏木精复染（可用盐酸酒精分化及氨水返蓝）。梯度酒精脱水，中性树胶封片。 阳性结果判断标准：肝细胞细胞核、胞浆或胞膜棕褐色着色。 其他事项：本试剂保质期为12个月。客户在收到产品时请及时检查，如发现有外包装破损、试剂盒成分不全等产品问题，或者在使用过程中有任何疑问，请及时与泰普客户服务中心联系，我们将及时为您解决。 公司信息：公司名称：福建泰普生物科学有限公司总部：福建省福州市金山金洲北路7号金山科技企业孵化器7号楼4层 邮编：350002 电话：800-804-8333，0591-2805 3600 传真：0591-2805 3700研发中心：北京市昌平区北清路中关村生命科学园创新大厦A座207室 邮编：102206 电话：010-8072 0071 传真：010-8072 0072操作步骤简表操 作参 数1二甲苯3X102100%酒精1X3395酒精1X3480酒精1X35蒸馏水1X36蛋白酶K消化37，307蒸馏水18过氧化物酶阻断剂室温，109PBS洗涤2x110蒸馏水111加杂交液适量12变性95，51330湿盒增效液的湿盒中孵育37，4-16h14PBS（用前48预温）脱片浸泡1-5+515PBS（用前48预温）浸泡3X516蛋白阻断