原代培养乳鼠窦房结细胞的形态学及表面抗原研究

1、原代培养乳鼠窦房结细胞的形态学及表面抗原研究         11-01-07 15:39:00     编辑：studa20                    作者：管思彬，马爱群，蒋文慧 【摘要】  目的 建立乳鼠窦房结细胞(SNC)的体外分离纯化培养方法，了解

2、SNC的形态结构特点，观察表面抗原超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因4(HCN4)和缝隙连接蛋白45(Cx45)的细胞表达特点，为细胞生物起搏的深入研究提供一定实验依据。方法 取新生SD乳鼠的窦房结组织，胰酶逐次消化，并予差速贴壁及5溴脱氧尿嘧啶核苷(5BrdU)纯化处理进行原代窦房结细胞的培养。结果 在培养的窦房结细胞中可观察到3种形态的细胞，即梭形细胞、三角形细胞和多边形细胞，其中梭形细胞所占比例最大，搏动频率最快，细胞器不发达，肌原纤维稀少，表达HCN4和Cx45；三角形细胞微量表达Cx45。结论 胰酶消化法结合差速贴壁及5BrdU处理，是可靠的窦房结细胞纯化培养技术；搏动频率最快、H

3、CN4和Cx45表达阳性的梭形细胞可能系窦房结起搏细胞。 【关键词】  窦房结细胞 细胞培养 HCN4ABSTRACT: Objective  To understand morphological characteristics of sinoatrial node cells (SNCs) by taking purified isolation and culture of neonatal rats SNCs in vitro and to understand the expression characteristics of surface antigens h

4、yperpolarization activated cyclic nucleotide gated cation channel 4 (HCN4) and connexin 45 (Cx45) on SNCs. Methods  The SNCs were isolated from sinus node tissues removed from neonatal rats by trypsin and purified cultured with differential attachment and 5bromodeoxyuridine (BrdU) treatment. Re

5、sults  Three different types of cells were observed among the purified cultured SNCs: spindle, triangular and irregular cells. The spindle cells took up the greatest proportion, had the fastest beats, and had less developed organelle and scarce muscular fibrils. Immunofluorescence staining was

6、positive against HCN4 and Cx45 on the spindle cells. Small amounts of HCN4 was observed on triangular cells. Conclusion  Isolation by trypsin combined with differential attachment and BrdU treatment is a reliable approach to culturing sinoatrial node cells. The spindle cells with the fastest be

7、ats and positive expressions of HCN4 and Cx45 may be the sinus node pacemaker cells.KEY WORDS: sinoatrial node cell; cell culture; HCN4心脏生物起搏已成为治疗窦房结病变所致缓慢型心律失常中的研究热点，其中关键是改善、恢复窦房结功能甚至重建窦房结。因而，了解窦房结细胞特别是窦房结起搏细胞的形态、抗原表达及功能特点可以更好的对其进行修复与替代。近年来关于窦房结细胞的培养已有若干报道13，但细胞表面抗原的研究较少，故本研究通过对原代培养的乳鼠窦房结细胞进行形态学及表面

8、抗原观察，旨在更好的了解窦房结细胞的特性，以期为生物起搏的研究提供一定实验依据。1 材料与方法1.1 材料出生2436h SD乳鼠，雌雄不限，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。4周龄SD雌性大鼠，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。SZ61型解剖显微镜、CK40型倒置生物显微镜、BX51型荧光生物显微镜(均为Olympus公司)、胰蛋白酶(Amresco公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、DMEM高糖培养基(GIBCO公司)、5溴脱氧尿嘧啶核苷(5BrdU，Sigma公司)、正常山羊血清(武汉博士德公司)、兔抗大鼠HCN4多克隆抗体(Alomone公司)、小鼠抗大鼠Cx45单克隆抗体

9、(Chemicon公司)、山羊抗小鼠IgGTRITC荧光二抗及山羊抗兔IgGFITC荧光二抗(北京中衫金桥生物技术公司)。1.2 方法取出生2436h SD乳鼠20只，仰卧固定，消毒并暴露心脏，在解剖显微镜下，于界嵴中部静脉窦侧、前腔静脉根部取0.8mm×0.8mm×0.8mm组织块；组织块置于DMEM液中，吹打清洗1min×2次，剪碎后加入0.6g/L胰酶，尖嘴吸管轻轻吹打1min，置于37水浴震荡12min，再吹打12min，自然沉淀，弃去上清液；再加0.6g/L胰酶，吹打1min，37水浴震荡9min，再吹打12min，自然沉淀，吸取上清液，移入离心管，加等

10、体积高糖DMEM培养液(含100mL/L胎牛血清)；重复消化34次至组织块基本消化成单细胞为止；细胞悬液离心，弃上清液，再用DMEM培养液洗涤细胞一次，离心，弃上清液；加入DMEM培养液(含136mL/L胎牛血清)，打散细胞团为单细胞悬液，调整细胞数为1×105个/mL，将单细胞悬液接种于培养瓶中；将培养瓶至于37、50mL/L CO2孵箱中培养2h后，应用差速贴壁分离技术，吸取培养瓶中的细胞悬液，收集至另一培养瓶或预先置有盖玻片(8mm×8mm)的6孔培养板中，加入5BrdU使其终浓度为0.1mmol/L，并继续培养，每12d换液1次，每次加入0.1mmol/L的5Brd

11、U。光镜观察：观察细胞形态，以手控计数器记录细胞收缩频率。透射电镜观察：培养5d后，倒置显微镜下选定培养板中长有细胞的盖玻片，取出后PBS洗涤、25mL/L戊二醛固定后送电镜室梯度脱水、包埋、切片，用透射电镜对超薄切片进行观察。取培养5d的乳鼠窦房结细胞进行HCN4和Cx45检测，随机分为HCN4和Cx45组。吸除培养孔中的培养液，PBS清洗2次；每孔细胞用40g/L多聚甲醛液室温固定20min，PBS液清洗3次；小心取出每孔盖玻片，置于载玻片上，各自滴加正常山羊血清，37 30min，甩去多余液体；滴加适当稀释的一抗(HCN4为1200，Cx45为12000，均用0.01mol/L PBS代

12、替一抗作为阴性对照)，4过夜，PBS液清洗3次；HCN4组滴加山羊抗兔 IgGFITC(1100)，Cx45组滴加山羊抗小鼠IgGTRITC(1100)，37 30min，PBS洗3次；300mL/L缓冲甘油封片；用BX51型荧光生物显微镜进行观察。FITC在490495nm激发，在520530nm发射黄绿色荧光。TRITC在550nm激发，在570nm发射红色荧光。共记录18个样本，观察30个高倍视野，实验数据以±s表示，采用SPSS10.0统计软件，进行单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。2 结 果2.1 光镜观察结果 细胞培养至第5天，经倒置显微镜观察，见培养的窦房结细胞有3种形态，即梭形、三角形与不规则形，其中梭形细胞最多，搏动频率最快(图1、表1)。表1  培养细胞的形态大小、搏动频率及所占比例（略）2.2 电镜观察结果 梭形细胞：细胞核较大，核仁明显，线粒体少，内质网、高尔基复合体不发达，糖原颗粒不丰富，肌原纤维不发达，仅见微量成束肌微丝在核周分布，未见完整肌节及Z线(图2A)。三角形细胞：线粒体丰富，内质网、高尔基复合体发达，糖原颗粒丰富，肌原纤维丰富，一般与细胞长轴平行, 有完整的肌节、Z线(图2B)。2