壁虎脊髓细胞的原代培养及形态学观察

1、壁虎脊髓细胞的原代培养及形态学观察         08-11-10 15:01:00     编辑：studa20                     作者：顾芸，刘梅，刘炎，顾晓松 【摘要】  目的：探讨壁虎脊髓细胞分离及培养方法。方法：分离壁虎脊髓，

2、消化接种于细胞培养瓶中, 采用不同渗透压、pH值、温度、消化、粘附基质的培养条件。结果：5CO2、饱和湿度培养条件，在添加10FBS的DMEM/F12培养基（渗透压200260mmol/kg，pH7.2）中，获得了不同细胞类型的细胞，其中包括神经元样和胶质细胞样细胞，神经元样细胞NF染色阳性，GFAP染色阴性，而胶质样细胞GFAP染色阳性。结论：建立了壁虎脊髓细胞分离及培养方法，为壁虎脊髓再生过程中基因的研究提供细胞水平功能平台。 【关键词】  细胞原代培养；传代培养；脊髓损伤；壁虎脊髓损伤是目前神经科学和其他相关学科研究的热点之一。传统观念认为，成体中枢神经系统损伤不能再生，脊髓损

3、伤后由于局部缺乏合适的微环境，损伤的神经元无法再生、修复。低等脊椎动物的脊髓有内在的再生能力1，但其再生的机制仍然是悬而未决的问题。爬行动物壁虎能够断尾再生，最明显的特征可能是脊髓的分化潜能2。因此，我们试图通过建立壁虎细胞培养的体外研究平台，从细胞学水平研究其再生机制，以期为脊髓损伤的修复提供依据。首次探讨了脊髓细胞的取材、分离及培养方法，并对细胞的形态学进行了研究，为后续的脊髓再生机制和基因功能研究打下基础。1   材料和方法11   动物来源   实验用动物捕获自野生环境，经鉴定为多疣壁虎（Gekko japonicus）。选择

4、成年正常壁虎4只，体重3.0±0.5g，全长约10cm，无断尾或其他损伤，雌雄不限。12   主要试剂   DMEM/F12培养基、胰酶、多聚左旋赖氨酸(Gibco)；胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料研究所)；兔抗GFAP多克隆抗体（DakoCytomation 公司)；兔抗NF200多克隆抗体、FITC标记羊抗兔二抗、TRITC标记羊抗兔二抗、Hoechst 33342（Sigma 公司）；其他试剂为国产分析纯。13   方法131   培养基组成   DMEM/F12培养基

5、，调渗透压为200260mmol/kg，pH 7.2。添加10胎牛血清，1双抗（青霉素和链霉素各100 IUL）和1谷氨酰胺。132   原代细胞培养   成年多疣壁虎4只，冰上麻醉，常规碘伏消毒皮肤后，去背部皮肤、肌肉后，用显微持针器将椎骨完全打开，将脊髓完整取下，立即置于预冷的DMEM抗生素液中(青霉素和链霉素各100IUL)，在解剖镜下将膜剥去，按下面的方法准备培养。用含有抗生素的DMEM液将脊髓充分清洗3遍，用眼科剪剪碎，加入0.25胰酶，在30孵育箱中孵育l520 min；完全培养液终止消化，制成细胞悬液。1000rpm/min离心10min后

6、去除上清液，加完全培养液4.04.5 ml，重悬细胞，调整细胞密度为1×105，种植于已用多聚赖氨酸包被的25cm2的细胞培养瓶内，于30°C，5 CO2，饱和湿度条件下培养，每天观察细胞形态。133   传代细胞培养   待细胞长成致密单层后即可进行细胞传代，弃去生长液，以0.25%胰酶消化，待消化完全后弃去胰酶，加适量新鲜生长液，反复吹打，制成单细胞悬液，然后以12或13传代，30培养，待长成致密单层时，再按上述方法传代。134   荧光免疫细胞化学分析   培养细胞胰酶消化后，种于浓度为0

7、.05mol/L 的多聚赖氨酸包被过的圆玻片上，培养24h后，经4% 多聚甲醛室温固定30min, 0.01mol/L PBS洗涤10min×3次、37条件下封闭60min后( 封闭液为含10%羊血清、0.1% Triton X-100 的0.01mol/L PBS液)，分别滴加一抗（兔抗GFAP，1500稀释；兔抗NF200，1200稀释），4放置过夜，0.01mol/L PBS洗涤10min×3次后，分别滴加FITC标记羊抗兔二抗（11000稀释）；TRITC标记羊抗兔二抗(11000稀释），以Hoechst（5g/ml）标记细胞核，室温、避光放置1h，0.01mol/

8、L PBS洗涤10min×3次，激光共聚焦显微镜观察免疫荧光细胞化学检测结果。2   结果21   细胞形态学观察   壁虎的脊髓细胞原代培养1周，只有少量细胞贴壁，培养瓶内可见到大量的细胞碎片，团块状絮状物及成团状或散在的细胞，该部分贴壁细胞，呈扁多角形、圆形或多边形。这些细胞胞核清楚、胞质清亮，细胞间充满黑色颗粒，被称作“窝形”细胞。培养2至3周后，细胞开始大量贴壁生长，除可观察到较多的细胞碎片、桑椹样堆积的圆形细胞外，逐渐出现一些纺锤形细胞；这些细胞先伸出一根突起，然后再伸出第二根突起，形成双极形细胞或梭形细胞。培养4

9、周后，可见较多成团生长的细胞，其形状基本可区分为扁平状细胞；多极形细胞；成纤维形细胞；双极形细胞；梭形细胞；纤维形细胞；星形细胞；窝形细胞八种类型(见封二图1)。其中扁平细胞胞体较大，平铺生长，增殖速度较慢；多极细胞呈团状生长，胞体呈多边形，有多个突起呈放射状排列；成纤维细胞有多个突起，胞体较大不规则，细胞增殖速度较快；梭形细胞和双极细胞的核呈扁卵圆形，位于细胞中部，细胞增殖速度快，生长具有方向性；纤维形和星形细胞成团生长，但联系松散，生长没有方向性。据报道“这些梭形、纤维形、星形和双极形细胞主要是胶质细胞，扁平细胞属上皮细胞，多极形细胞为神经元，窝形细胞可能是未分化的神经胶质细胞”。壁虎细胞原代培养的时间较长，大约5周左右才能形成致密单层，传代时间为1周1次，细胞可以传到第8代。22   荧光免疫细胞鉴定   通过间接免疫荧光的方法，在激光共聚焦显微镜下检测到多极形细胞为NF表达阳性（见封二图2），GFAP表达阴性（见封二图3），检测到纤维形细胞GFAP表达阳性（见封二图4）。23   温度、渗透压和pH值的变化对细胞生长的影响   将原代的壁虎细胞分别置于温度为