hiv抗体检测技术 课件

1、l艾滋病病毒的形态艾滋病病毒的形态v HIVHIV的逆转录酶缺乏的逆转录酶缺乏3 35 5核酸外切酶活性核酸外切酶活性 ，v 无法修复逆转录和复制过程中发生的错误无法修复逆转录和复制过程中发生的错误 。HIV生活周期生活周期吸附穿入脱壳生物合成组装成熟和释放吸附穿入脱壳生物合成组装成熟和释放HIV-1HIV-1通过通过gp120gp120与靶细胞外表与靶细胞外表CD4CD4分子和趋化因子受体结合分子和趋化因子受体结合l高度依赖实验室诊断高度依赖实验室诊断lHIVHIV检测的严肃性：检测的严肃性：l 保证输血、器官移植的平安保证输血、器官移植的平安l 错误结果将导致严重的法律问题错误结果将导致严

2、重的法律问题l结果严格保密结果严格保密诊断诊断：确定个体：确定个体HIVHIV感染状况而进行的检测，感染状况而进行的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。根据特殊需要进行的体检等。监测监测：了解不同人群：了解不同人群HIVHIV感染率及其变化趋势感染率及其变化趋势而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群和一般人群。和一般人群。血液筛查血液筛查：防止输血传播：防止输血传播HIVHIV而进行的检测，而进行的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。包括献血员筛查和原料血浆筛查。HIVHIV抗体检

3、测目的抗体检测目的行业标准行业标准: :? ?艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准?WS298-2021?WS298-2021技术标准技术标准: :? ?全国艾滋病检测技术标准全国艾滋病检测技术标准? ? 2021 2021年修订版年修订版 l筛查试验筛查试验初筛初筛复检复检l确证试验确证试验HIVHIV抗体检测程序抗体检测程序筛查试剂筛查试剂l必须是经国家食品药品监督管理局必须是经国家食品药品监督管理局l注册批准、在有效期内的试剂，其中注册批准、在有效期内的试剂，其中l酶联免疫试剂应批批检合格。推荐使用酶联免疫试剂应批批检合格。推荐使用l临床质量评估敏感性和特异性高的

4、试剂。临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。HIVHIV抗体筛查样品抗体筛查样品l血清、血浆、滤纸干血斑、唾液和尿液。血清、血浆、滤纸干血斑、唾液和尿液。初筛试验初筛试验对呈阴性反响的样品，可出具对呈阴性反响的样品，可出具HIVHIV抗体阴性抗体阴性- -报告；报告；对呈阳性反响的样品，需要进一步对呈阳性反响的样品，需要进一步做复检试验和确证试验。做复检试验和确证试验。复检试验复检试验对初筛呈阳性反响的样品，应使用对初筛呈阳性反响的样品，应使用原有试剂和另外一种不同原理或厂家原有试剂和另外一种不同原理或厂家的试剂，或另外两种不同原理或不同厂家的试剂，或另外两种不同原理或不同厂家的试剂进行复检试验

5、。的试剂进行复检试验。如果初筛检测使用抗原抗体联合试剂，那么复检必如果初筛检测使用抗原抗体联合试剂，那么复检必须包括一种抗原抗体联合试剂。须包括一种抗原抗体联合试剂。艾滋病检测筛查实验室复检判定为阳性反响的样品，艾滋病检测筛查实验室复检判定为阳性反响的样品，确证实验室可以直接进行确证试验。确证实验室可以直接进行确证试验。筛查方法筛查方法酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验ELISAELISA化学发光或免疫荧光试验化学发光或免疫荧光试验CLIACLIA：采用发光或荧光底物，用发光或荧光仪采用发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。测定结果。快速检测快速检测RTRT及其它检测试验及其它检测试验 (1)

6、 (1)明胶颗粒凝集试验明胶颗粒凝集试验(PA)(PA) (2) (2)斑点斑点EIAEIA和斑点免疫胶体金或胶体硒和斑点免疫胶体金或胶体硒快速试验快速试验 (3) (3)免疫层析试验免疫层析试验HIVHIV抗体筛查试验抗体筛查试验l可使用血液、唾液、尿液样品可使用血液、唾液、尿液样品l单纯单纯HIV抗体检测试剂抗体检测试剂lHIV抗原抗体联合检测试剂：同时检测血液中抗原抗体联合检测试剂：同时检测血液中l HIV-1P24抗原和抗原和HIV-1/2抗体。抗体。lHIV抗原或抗体包被于固相载体，参加待检样品抗原或抗体包被于固相载体，参加待检样品l和酶标记的和酶标记的HIV抗原或抗体，加底物显色，

7、用酶标仪抗原或抗体，加底物显色，用酶标仪l测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。 固相抗原固相抗原标本（含抗体）标本（含抗体）酶标二抗酶标二抗底物底物EEE间接法检测抗体间接法检测抗体E固相抗原固相抗原标本（含抗体）标本（含抗体）酶标抗原酶标抗原底物底物EE双抗原夹心法检测抗体双抗原夹心法检测抗体ELISAELISA法结果判断法结果判断临界值概念临界值概念: : 将检测的阳性和或阴性对照的将检测的阳性和或阴性对照的ODOD值值代入计算公式计算出来的判断阳性和阴性结果的界值代入计算公式计算出来的判断阳性和阴性结果的界值判断标准

8、判断标准: :标本标本ODOD值与临界值的比值大于等于值与临界值的比值大于等于1(S/CO1)1(S/CO1)为阳性对间接法及双抗原夹心法为阳性对间接法及双抗原夹心法注意注意: :不同厂家、不同方法临界值计算公式不同不同厂家、不同方法临界值计算公式不同四代艾滋病酶联免疫试剂比较四代艾滋病酶联免疫试剂比较solidphasespecificdetection ofconjugate第一代第一代病毒裂解液病毒裂解液HIV-1IgG 抗体抗体HIV-1 -IgG抗体抗体第二代第二代病毒裂解液病毒裂解液重组抗原合成肽重组抗原合成肽HIV-1 / -2IgG 抗体抗体HIV-1 / -2 IgG抗体抗体

9、第三代第三代病毒裂解液病毒裂解液重组抗原合成肽重组抗原合成肽HIV-1 / -2 / -OIgM / IgG 抗体抗体HIV-1 / -2 / -O病毒裂解液病毒裂解液重组抗原合成肽重组抗原合成肽HIV-1 / -2 / -O第四代第四代病毒裂解液病毒裂解液重组抗原合成肽重组抗原合成肽HIV-1 / -2 / -Oanti-p24 AbIgM / IgG 抗体抗体HIV-1 / -2 / -Op24 抗原抗原病毒裂解液病毒裂解液重组抗原合成肽重组抗原合成肽HIV-1 / -2 / -Oanti-p24 抗体抗体method间接间接间接间接夹心夹心夹心夹心酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验ELIS

10、AELISA优点：准确性高、价格低廉、优点：准确性高、价格低廉、 判断结果标准客观、判断结果标准客观、 结果便于记录和保存结果便于记录和保存用途：流行病学监测及临床大量标本的检测用途：流行病学监测及临床大量标本的检测(2)化学发光或免疫荧光试验化学发光或免疫荧光试验采用发光或荧光底物，既可检测抗体，也采用发光或荧光底物，既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体。可联合检测抗原抗体。HIVHIV抗原或抗体包被于固相载体，参加待检抗原或抗体包被于固相载体，参加待检样品和酶或荧光标记的样品和酶或荧光标记的HIVHIV抗原或抗体，加抗原或抗体，加发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结发光或荧光底物，用发光或荧

11、光仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。试剂盒规定。 3 3快速检测快速检测RTRT及其它检测试验及其它检测试验优点优点: :试验简便快速，适用于应急检测、门诊试验简便快速，适用于应急检测、门诊急急 诊检测。诊检测。不需专门设备不需专门设备, ,人员培训简单人员培训简单, ,一般可在一般可在10103030分钟内得出结分钟内得出结果。果。缺点缺点: :肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。保存。HIV快速检测试剂按原理不同，分为以下三类：快速检测试剂按原理不同，分为以下三类： 1 免疫渗滤试验：以硝酸纤维

12、膜为载体，免疫渗滤试验：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点抗原点状状 固定在膜上。加待检样品后，阳性结果在膜上抗固定在膜上。加待检样品后，阳性结果在膜上抗原部位显示出原部位显示出 有色斑点。有效试验质控点必须显色。有色斑点。有效试验质控点必须显色。 2 免疫层析试验：以硝酸纤维膜为载体，免疫层析试验：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原线抗原线状状 固定在膜上，加待检样品后，阳性结果在膜上抗固定在膜上，加待检样品后，阳性结果在膜上抗原部位显示出原部位显示出 有色条带。有效试验的质控带必须显有色条带。有效试验的质控带必须显色。色。 3 明胶颗粒凝集试验明胶颗粒凝集试验PA：将：将HIV抗原致敏明胶抗原致

13、敏明胶颗粒颗粒 作为载体，加待检样品后。当待检样品含有作为载体，加待检样品后。当待检样品含有HIV抗体时，明胶颗抗体时，明胶颗 粒与抗体发生凝集反响，根据粒与抗体发生凝集反响，根据凝集情况判读结果。凝集情况判读结果。 1 1明胶颗粒凝集试验明胶颗粒凝集试验PAPA将将HIVHIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后保温一般为室温。当待品作用，混匀后保温一般为室温。当待检样品含有检样品含有HIVHIV抗体时，经抗原致敏的明胶颗抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原粒与抗体发生抗原- -抗体反响，根据明胶颗粒抗体反响，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判

14、读结果。在孔中的凝集情况判读结果。快速诊断试剂快速诊断试剂PAPA法原理法原理PAPA法操作步骤法操作步骤PA法法2 2斑点斑点EIAEIA和斑点免疫胶体金或胶体硒和斑点免疫胶体金或胶体硒以硝酸纤维膜为载体，以硝酸纤维膜为载体，HIVHIV抗原点状固定在膜上抗原点状固定在膜上, ,加血清加血清样品。样品。斑点斑点EIAEIA法用酶标记抗体，以后步骤同法用酶标记抗体，以后步骤同ELISAELISA。斑点免疫胶体金或胶体硒用红色的胶体金或胶体斑点免疫胶体金或胶体硒用红色的胶体金或胶体硒硒A A蛋白标记，用渗滤法作为洗涤方法。蛋白标记，用渗滤法作为洗涤方法。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反响

15、时间在阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反响时间在10 min10 min以内，使用抗原量少。以内，使用抗原量少。快速诊断试剂快速诊断试剂金标诊断试验原理金标诊断试验原理快速诊断试验快速诊断试验3免疫层析试验(金标法、硒标法)以硝酸纤维膜为载体。加样区：预包被胶体金-抗原/胶体金-protein A结合物测试区T：固定有重组HIV抗原，质控区：抗HIV单克隆抗体/抗-protein A抗体快速诊断试剂快速诊断试剂全血样品 加50ul样品于样品垫中手指血方法静脉血方法加一滴缓冲液15分钟内读取结果硒标法操作步骤硒标法操作步骤病人条质控条快速诊断试验快速诊断试验优点优点: :试验简便快速，适用

16、于应急检测、门诊急试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测。诊检测。不需专门设备和人员培训不需专门设备和人员培训, ,一般可在一般可在10103030分钟内得出结果。分钟内得出结果。缺点缺点: :肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。存。注意：一定要将试剂平衡至室温注意：一定要将试剂平衡至室温快速诊断试剂快速诊断试剂HIV抗体确认试验抗体确认试验确认试验的试剂：确认试验的试剂： 必须是经国家食品药品监督管理局必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。注册批准、在有效期内的试剂。确认试验方法：确认试验方法：免疫印迹试验免疫印迹试验(WB)(

17、WB)条带免疫试验条带免疫试验(LIATEK HIV)(LIATEK HIV)放射免疫沉淀试验放射免疫沉淀试验(RIPA)(RIPA)及免疫荧光试验及免疫荧光试验(IFA)(IFA) 国内常用确实认试验方法国内常用确实认试验方法是是WBWB。a 强阳性对照（强阳性对照（HIV-1和和HIV-2）b弱阳性对照（弱阳性对照（HIV-1）c阴性对照阴性对照d典型的典型的HIV-2血清阳性反应血清阳性反应HIV核酸定性检测 规定了核酸检测、核酸序列测定的实验室条件、检测方法及结果判定标准 结果报告 ： HIV核酸检测阴性:只可报告本次实验结果阴性。 HIV核酸检测阳性:可作为诊断HIV感染的辅助指标，

18、不单独用于HIV感染的诊断。严格的实验室管理制度分区、仪器和材料的专用、单向流向、废弃物处理 HIV RNA定量测定病毒载量测定 方法 常用的HIV RNA定量测定方法有逆转录PCR试验RT-PCR、核酸序列扩增试验NASBA、分支DNA杂交试验bDNA。 HIVHIV核酸定量检测的意义核酸定量检测的意义辅助诊断：当RNA测定出现较高拷贝数的阳性结果时3，000c/ml，感染发生的可能性非常大。应综合其它检测数据和样品背景情况进行综合判断。 早期诊断 ：HIV感染孕妇所生婴儿 、剩余危险度 病程监控 ：确定疾病开展的阶段，以确定相应的治疗方案。 指导治疗方案及疗效判定 ：通常在治疗前后病毒水平

19、降低0.5 log以上才被认为临床有效。 预测疾病进程 适用范围：适用范围：HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊抗体不确定或窗口期的辅助诊断；断； HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别诊断；辅助鉴别诊断；第四代第四代HIV-1抗原抗原/抗体抗体ELISA试剂检试剂检测呈阳性反响，但测呈阳性反响，但HIV-1抗体确认阴性抗体确认阴性者的辅助诊断；者的辅助诊断；监测病程进展和抗病毒治疗效果。监测病程进展和抗病毒治疗效果。检测方法：通常是采用检测方法：通常是采用ELISA双抗体夹双抗体夹心法。心法。 HIV P24抗原的检测抗原的检测 结果报告和解释 HIV-1 P

20、24抗原的阳性结果必须经过中和试验确认，假设阳性标本的OD值比中和反响前减少50%以上，才确定为HIV P24抗原结果阳性。HIV-1 P24抗原阳性仅作为HIV感染窗口期的辅助诊断依据，不能据此确诊。HIV-1P24抗原检测的敏感性为3090，低于病毒载量测定。HIV-1P24抗原阴性结果只表示在本试验中无反响，不能排除HIV感染。筛查试验阳性反响样品筛查试验阳性反响样品HIV抗体抗体确证检测流程图确证检测流程图结合流行病学资料，可以在结合流行病学资料，可以在4 4周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应，周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应，则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，则报告阳性；如随访期间带型有进则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，则报告阳性；如随访期间带型有进展，但不满足阳性标准，应继续随访到展，但不满足阳性标准，应继续随访到8 8周。如带型没有进展或呈阴性反应周。如带型没有进展或呈阴性反应则报告阴性；满足则报告阴性；满足HIVHIV抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性判断标准抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性判断标准