为基础的TRFLP应用于乳品发酵中新陈代谢活性细菌的半定量分析百替生物

1、RT-PCR为基础的T-RFLP应用于乳品发酵中新陈代谢活性细菌的半定量分析Jorge I. Sa´nchez a, Lia Rossetti b, Beatriz Mart´nez a,Ana Rodr´guez a, Giorgio Giraffa b,*a Instituto de Productos La´cteos de Asturias (IPLA-CSIC), ctra. Infiesto, s/n, 33300 Villaviciosa, Asturias, Spainb Istituto Sperimentale Lattiero Ca

2、seario, via A. Lombardo 11, 26900 Lodi, ItalyReceived 2 February 2005; received in revised form 21 July 2005; accepted 28 July 2005Available online 21 September 2005（杨明翻译）摘要：一种包括RT-PCR扩增全部微生物群落的16S rRNA和T-RFLP的方法，对于在确定的乳酸乳球菌乳酸亚种和柠檬明串珠菌菌株培养中半定量的描述新陈代谢活性数量是最优的，这是两种在奶酪生产中被通常使用的嗜温的乳酸菌种。选择好的PCR引物高效地扩增这两个

3、菌种的16S rRNA。用DdeI消化PCR产物生产每种菌种的不同的末端限制性酶切片段（T-RFs）。然而，由于嵌合分子的形成和来源于部分单链16S rRNA的扩增子的假T-RFs产生的额外的T-RFs在两个菌种中都被观察到了，尽管是很少量的。为了避免过量PCR产物对定量DNA产生的饱和效果导致的对总量的低估和尽量减少假片段的出现，20个PCR循环是最佳的。当应用于混合乳品培养时，T-RFLP分析表现出很好的可重复性。用这种方法和结果研究包括乳酸乳球菌乳酸亚种菌株和柠檬明串珠菌菌株的两种混合初始物的动力学，并和用纯培养获得的做对比。这些数据显示了用T-RFLP进行半定量微生物数量分析的适宜性。

4、某些微小的差别可以用菌落计数不能被检测到的新陈代谢活性细胞的出现来解释。以RT-PCR为基础的T-RFLP可以作为传统方法之外的另外一种选择，用于研究相对简单的微生物（比如确定乳品起始物的培养物）生态系统的新陈代谢活性的群体动力学。关键词：乳品初始物；RT-PCR；半定量；T-RFLP1前言几种奶酪生产中常用的初始培养物通常包括成酸性的乳球菌，和一些通常属于乳酸乳球菌乳酸亚种、二丁酮链球菌和明串珠菌属某些种的利用柠檬酸盐的菌株。这些培养菌对于器官感觉的特征的发展是非常重要的（Ca´rcoba et al., 2000.）。确定的菌株的初始物已经被奶酪制造商日益增多地采用，作为一种尝试

5、来解决与未受控制的自然发酵相关的问题。这对于奶酪的质量有积极的效果。因为整个发酵过程中菌株的平衡是一个关键点，所以需要监控任何对细菌群落结构的暂时影响，这些影响可能改变想得到的奶酪的特性的正确过程。（Giraffa, 2004）培养作为一种评价食品中微生物群落多样性和动力学的方法已经有几十年了。以培养为基础的方法被长期接受并获得普遍成功，但是这些技术费时费力，而且在某些情况下不一定能提供微生物群落组成的可靠信息。未知的和不可培养的种的出现以及样本的混合和稀释步骤会对微生物的生存能力产生影响，能够导致对产品真实生态学组成的失真的观察（Fleet，1999）。而且，在不利条件下，比如营养耗尽、低温

6、和其他压力，某些微生物能进入可生存的但不可培养（VNC）的状态。VNC状态的微生物仍然具有新陈代谢活性但是不能在通常支持它们生长的培养基上形成菌落，因此它们不能被传统的方法发现。为了克服这些问题，免培养法比如变性梯度凝胶电泳/温度梯度凝胶电泳（DGGE/TGGE）、单链构象多态性（SSCP）、荧光原位杂交（FISH），或者以PCR为基础的技术比如长度异质PCR（LH-PCR）和末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）在过去几年得到发展（Giraffa and Neviani,2001）。T-RFLP是一种分析不同细菌的16s rRNA的差异，并提供微生物种群结构信息的方法（Osborn et

7、al.,2000）。它是以限制性核酸内切酶消化荧光末端标记的PCR产物为基础的。单独的末端限制性酶切片段（T-RFs）被电泳分开并由荧光信号亮度量化。依靠微生物群落的物种组成，获得明显的外形（T-RF图案），一种代表一个物种的存在。一个相对定量的分布可以获得，因为每个顶点的荧光密度是和混合物中每个物种的DNA量成比例的。然而，PCR的偏差可能对微生物群落真实组成的量化产生消极的影响（Suzuki and Giovannoni, 1996; Suzuki et al.,1998）。以DNA为基础的方法的缺点是不能区分活的和死的生物体，因为溶解细胞中的DNA能够在自然环境中存在很长时间（Bents

8、ink et al.,2002; Wolffset al.,2005）。因此，以DNA为基础的PCR不能区分生活的、VNC和死细胞，这就限制了它用于监控目的的使用（Sheridanet al.,1998）。在死细胞中RNA比DNA降解的快（Van der Vliet et al.,1994），因此，逆转录酶PCR（RT-PCR）可能是生存能力、新陈代谢活力和细胞完整性的一个好的指示器（Bentsink et al.,2002）。这项工作的目的是检验与RT-PCR相连系的T-RFLP监控确定微生物种群（比如乳品确定菌株的初始物）的新陈代谢活性部分的群体动力学的能力。在这一点上，研究了整个发酵过程

9、中两种确定菌株的初始物的成分的演变。为了减少PCR的偏差，这种方法被最优化并且检验了它的可重复性。2材料与方法2.1细菌菌株和生长条件本研究中使用的细菌菌株包括从人工奶酪中分离的两株柠檬明串珠菌菌株（IPLA621和IPLA1687）和一株乳酸乳球菌乳酸亚种菌株（IPLA947）（Cuestae=qt al.,1996）。明串珠菌属在MRS肉汤（Biokar, Beauvais, France）和乳球菌在M17（Scharlau Chemie, Barcelona, Spain）中被常规地繁殖。2.2 确定菌株初始物培养两种确定菌株初始物培养物在10%（wt/vol）复配脱脂乳（RSM）中准备

10、；培养物A包括乳酸乳球菌乳酸亚种IPLA947和柠檬明串珠菌IPLA621，培养物B包括乳酸乳球菌乳酸亚种IPLA947和柠檬明串珠菌IPLA1687。前一夜的肉汤培养物在乳中1%被转接，给与起始的种群比率，大约是31.3，分别为乳球菌和明串珠菌。培养物在30培养，并于0，3，6，9和24小时取样。2.3 微生物分析10倍稀释法在四分之一浓度套环溶液被使用，在含有万古霉素（30 mgml-1）的MRS琼脂和为明串珠菌准备的蔗糖（2% wt/vol）或者为乳球菌准备的加入环己米特的M17琼脂中进行选择性计数。平板在30培养48小时。2.4 DNA提取在MRS或者M17培养基上生长的纯培养物的DN

11、A用如前文描述的基于chelex的程序进行提取。分离的DNA在使用前在-20温度下保存。2.5 从培养物中提取RNA用9ml EDTA（1% wt/vol, pH 12）预处理从乳培养物得到的1ml样品，使凝固的酪蛋白分散以利于细胞的分离。样品在8000×g离心5分钟，然后用TE buffer洗两次。沉淀物在含有lysozime（20 mg ml -1）的100l的TES中重悬，然后37培养30分钟。提取RNA使用Trizol公司的试剂（Invitrogen S.r.L., Milano, Italy），按照厂家提供的说明书进行操作。沉淀物在50l用DEPC处理的水中重悬，污染DNA

12、消化在5U的Amplification Grade DNA酶I（Sigma Aldrich, Milano, Italy）在厂家给定的条件下。RNA的量和纯度用260和280nm的光密度确定（Sambrook et al., 1989）。提取的RNA在使用前保存在-80。2.6 引物选择扩增16S rRNA可变区的A域的基因，使用荧光标记的正向引物63F（5V-6FAM CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3V）（Marchesi et al., 1998）和未标记的反向引物355R （5V-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3V）（Suzuki et al.

13、, 1998）。.2.7 RT-PCR使用Gene Amp EZ rTth RNA PCR 试剂盒（Applera Italia, Monza, Italy），按照厂家的说明进行一步PCR。反应在终容量为25l的体系中进行，包括5l的5×EZ buffer，3l的dNTP混合液（每种dNTP浓度10mM），2.5l的mM Mn （OAc）2溶液，每种引物溶液1.25l（10M），1l的rTth DNA 聚合酶（2.5 U l-1；Applera Italia）和2.5 l 的 RNA模板（稀释到100 ngl-1）。反应在Perkin Elmer thermal cycler （mo

14、d. 9700;Applera Italia）中进行，反应条件为：60初始变性步骤于941min，接下来进行循环，循环数由样品决定（10，20，30或者40）。循环条件为：94 15s（变性），49 30s（退火），72 30s（延伸）。最后一步72 7min。为了检查RNA提取物中可能存在的DNA污染，按照上述方法使用RNA提取物作为模板进行对照反应。2.8 PCR扩增提取的DNA和对照PCR在终体积为20l的体系中进行，其中含有2l的10×Gold buffer （Applera Italia），1.6l的dNTP混合液（每种dNTP浓度2.5mM），1.2l的MgCl2（25m

15、M），每种引物的溶液1l（10M），0.1l的AmpliTaq Gold DNA 聚合酶（Applera Italia）和1l的DNA样品（或者对照反应的RNA）。反应条件为，95 10min；25个循环 95 40s，49 45s，72 2min；最后一步72 7min。2.9 限制性核酸内切酶的选择乳酸乳球菌乳酸亚种和柠檬明串珠菌（GenBank的编号分别为AF111948 and AB118036）的16s rRNA基因序列，用Sequence Navigator software （version ,Applied Biosystems, Foster City, CA）进行排序。为了

16、选择限制酶，用一种核苷序列限制位点图在线软件Webcutter 2.0（网络地址为：）进行分析。酶切反应使用10U限制酶DdeI（New England Biolabs,Beverly, MA, USA），在20l体系中进行1.5h，按照厂家的建议的条件进行。2.10 T-RFLP分析扩增产物的变性和电泳按照全面描述的方法进行（Lazzi et al., 2004）。电泳结果在非变性条件下用ABI Prism 310基因分析仪（Applied Biosystems）进行分析，T-RFLP结果使用Genescan 软件（version3.1; Applied Biosystems）进行分析。（叶

17、彦波翻译）3. 结果检查所选引物可行性以及PCR产物的大小的预试验用提取于纯培养物的DNA。从每个菌落利用引物扩增真细菌rDNA的A区域，PCR产物长319±1 bp，为乳酸乳球菌乳酸亚种（Lazzi et al.,2004），和长318 ±1 bp的柠檬明串珠菌（数据未显示）。因为两者PCR产物的大小差异很小，以致无法精确辨别这些种，样品用 DdeI 消化产生一种特殊的标记了的T-RF。 依照在线的限制分析，当以 DdeI（图 1）消化的时候，每个种有一个独特的式样。实验数据通过silico分析被确认，乳酸乳球菌表现为一个259 ± 1bp的峰， 柠檬明串珠菌的

18、为 141 ±1 bp （数据未显示）。这些数据证明了引物以及挑选的限制酶可以用来确认两个种的能力。相同的消化也用于T- RFLP 分析扩增的rRNA。 图 1.在线限制分析确认的乳酸乳球菌乳酸亚种和柠檬明串珠菌的DdeI的限制位点，乳酸乳球菌乳酸亚种和柠檬明串珠菌的PCR产物以引物63F和355R扩增。3.1 来自牛奶培养物的RNA提取和RT-PCR从牛奶培养物被提取RNA，RT-PCR用于检测提取方法和RT- PCR 的适合条件。对于第一种尝试，扩增反应设置了40个循环。一条大约319 bp的带在所有样品中都可以看到（图2A，上胶板），确认预期片段的扩增。负对照缺少扩增带确认了没

19、有DNA污染发生。（图2A，下胶板）。RT- PCR的产物利用Dde I酶切消化并利用毛细管电泳分离产生的片断。单独的乳酸乳球菌牛奶培养物的RT- PCR产物酶切电泳图在图2 B中显示。次级峰（279 ±1，287 ±1，299 ± 1和 319 ±1 bp）连同259 ±1 bp的预期峰同样被发现，尽管浓度相对较低。这些额外的峰对应的是额外的扩增子，因为当同样的样品不经消化跑毛细管电泳时也被观察到（见图2 C）。在这种情况下，除了319 ±1 bp片断外，对应于339 ±1，359 ± 1，379 ±

20、1和 397 ±1 bp片段的另外的峰也被发现。 这些非预期的产物可能是由于非特异性的引物退火或者是由PCR时基因组中16S rRNA的不同拷贝的重结合造成的，不同的产物恰好可以反映16S rRNA的序列特异性（Wang and Wang，1997）。DdeI 酶切消化在所有片段的3端产生了一个60 bp（事实上是28和32 bp的二个片断，因为限制位点在287 bp） 的非标记片断（图 2 D），显示序列特异性更靠近5端。缺失这一个60bp片断可以解释产物消化后观察到的五个峰中四个的出现，也就是259 ±1（主要产物），279 ± 1，299 ±1 和

21、 319 ±1 bp。对应于397 ±1 bp的峰在被消化的样品中没有出现，或许因为在消化期间的稀释使它的浓度太低未被发现。被消化的样品（图 2B）中的287 ±1 bp的峰与假终端限制片断的形成相关（假的T-RFs）。这些假片断在PCR期间因为部分单链16S rRNA模板的形成被起始，可能是由于模板的二级结构，导致聚合酶停止。因为限制型内切酶需要双链DNA，因此终点的限制位点不具有功能（Egert和Friedrich.2003）。在我们的情况，总DNA中的一些在第一个限制位点不被 DdeI酶切产生一个259 bp的片断，而是在第二个位点酶切因此产生一个287 &

22、#177; 1bp 的假T-RF（见图 1）。 相似的结果在柠檬明串珠菌中也获得，呈现出160± 1，179±1和287±1 bp的三个次级非预期峰（数据未显示）。3.2. RT-PCR和T- RFLP的条件最佳化PCR循环数对于检测DNA的影响在牛奶的乳酸乳球菌纯培养物上被评估。当设置10个循环时，最初的259 ±1bp的T-RF是被发现的唯一峰。循环数的逐渐增加导致另外的峰出现。287 ±1bp的假T-RF在20个循环之后被观察到，而在30个循环之后由于错配起始的其他次级峰也被观察到（数据未显示）。尽管使用10个循环可以把次级峰的减到最低，

23、但由于相对产生的主峰的面积太小，种群数目的微小变化可能会导致信号的完全消失，这使得这样的条件不可行。因此，20个循环对于进一步的分析是最好的选择（表1）。图3显示了对应于从牛奶培养的乳酸乳球菌IPLA947纯培养物的主要RT-PCR产物（319 ±1 bp）的峰区域，以及其相应的DdeI 消化后获得的主要的T-RF（259 ± 1bp）。可以观察到未消化的DNA的峰面积在超过 20个循环后并没有增加。然而，被消化的DNA（由于限制性内切酶切，与未消化的DNA相比被稀释4倍）的峰面积在PCR循环的数量从20个循环到30个循环的过程中增加了。这暗示PCR产物过量下所引起的一种D

24、NA定量的饱和效果。为了要避免系统的饱和，这种饱和可能会造成一些种群成员的低估，一个120,000个单位的峰面积被设为准确测量的上限。图 2. （A）上面的胶板: 从牛奶培养物提取的RNA扩增40个循环后的 RT- PCR 产物。2到7泳道： 单个培养物（2,3: IPLA947；4,5: IPLA621; 6,7: IPLA1687）。8到11泳道：混合培养物（8,9: IPLA947 和 IPLA621；10,11：IPLA947 和 IPLA1687）。12泳道：PCR对照。1和13泳道：分子量 DNA标记1 kb以及DNA梯度标记 （意大利生命技术公司，米兰，意大利）。下面的胶板：对照

25、PCR确定没有DNA污染。（B 和 C）单个牛奶培养物培养的乳酸乳球菌乳酸亚种IPLA947中提取的总RNA RT-PCR（40个循环）DNA 片断DdeI 消化后（B）或未消化的（C）的图。（D）错配分子次级 T-RFs的形成。扩增产生主要的产物（319 bp）和一些另外的片断（339，359，379 和 397 bp）。DdeI 消化在所有扩增产物中都释放一个未标记的 60 bp 片断，和 259（主要的消化扩增子），279，299，319 和 337 bp大小的T-RF。以 287 bp的DdeI限制位点未显示。 表1 使用不同RT-PCR循环数的乳酸乳球菌乳酸亚种IPLA947 的16

26、s rRNA扩增子的限制片断ND: 未发现。 a：主要的T-RF。 b：错配分子消化产生的片断。c：假的T-RF。表2以RT-PCR为基础的T- RFLPa的重复性a：每个峰面积通过同一样品的三次独立分析确定，包含一个乳酸乳球菌和柠檬明串珠菌菌株，在RSM中30培养9 h 后测定。独立分析包括RNA提取，RT-PCR（20个循环），内切酶消化和毛细管电泳。 b：柠檬明串珠菌的T-RF。 c：乳酸乳球菌乳酸亚种的 T-RF 。 d：假的T-RF。 图3. 用萤光强度显示DNA定量的饱和效果。数据表示用 DdeI（259 bp）消化的或未消化 （319 bp）在10，20或30个PCR循环后RT-

27、PCR扩增子主要片段的峰面积。消化样品的浓度是未消化的四分之一，这是因为消化步骤的稀释。 3.3 T- RFLP的重复性为了测试T- RFLP分析的重复性，培养物A作为样品，包括乳酸乳球菌乳酸亚种IPLA947和柠檬明串珠菌IPLA621，发酵后9h取出，分别用于三个独立的分析包括RNA提取，RT-PCR，内切限制酶切和毛细管电泳分析。表2显示了柠檬明串珠菌（141 ± 1bp）和乳酸乳球菌（259 ± 1bp） 的T-RFs的峰面积，以及假的T-RF（287 ±1bp）的峰面积。所有峰三个样品之间的标准差在 7% 以下。同样地，峰面积与乳酸乳球菌以柠檬明串珠菌的

28、T-RF之间的比的标准差为4.1%，指示在单一样品里两个菌株相对定量的重复性很好。 （陈忠良）3.4 应用T- RFLP监测初始培养物的群体动力学为了测定T-RFLP监测群体动力学的能力，在牛奶培养物中培养的样品同时利用菌落计数以及发酵过程中的T-RFLP的分析，然后对结果进行比较。 化验包含两种确定的菌落的起始物，乳酸乳球菌乳酸亚种和柠檬明串珠菌。图4显示发酵中两培养物的进化。培养物A中两者表现为相似的行为，9 h到达静止期。可培养细胞数直到潜伏期结束保持不变。在培养物B中，可以在9 h之后观察到柠檬明串珠菌IPLA1687的可培养细胞数的减少，可能是被酸和/或其他的压力条件引起。乳酸乳球菌

29、IPLA947的生长看起来并没有因IPLA621或IPLA1687的出现而改变。 平行的，RT-PCR扩增片段的T-RFLP分析也被进行。相应每个菌株T-RF的峰面积被测量，为了对新陈代谢活性群体进行半定量分析，它们之间的比率也被计算出来。在培养物A中，T- RFLP分析与发酵时期菌落计数相比菌落IPLA947 和IPLA621 的相对比例的波动更大。然而，IPLA947（75.3% 和 75.1%）和IPLA621（24.7%和24.9%）T-RFLP和菌落计数的平均菌体总数，分别地，在发酵的最初9 h是相似的。24h后两种技术的差异则会相当明显。通过定量T- RFLP计算得来的IPLA94

30、7 的比例比通过菌落计数得来的数据大。这表明部分细胞仍具有新陈代谢活力，但是处于VNC状态，因此，不能通过接菌发现。另一方面，培养物B的群体动力学用两种技术显示出相似的结果（图5 B，5 D）。IPLA947 的相对总数随着发酵过程逐渐增加，特别是6h以后当IPLA1687的可培养总数明显的减少时。两个技术之间的最大不同在24 h再次被发现。如上讨论，VNC细胞的出现, 在IPLA1687的情形下，可以解释经由以RT- PCR为基础的T-RFLP观察得来的较高比例。图4. 培养物A中（乳酸乳球菌乳酸亚种IPLA947和柠檬明串珠菌IPLA621）以及培养物B（乳酸乳球菌乳酸亚种IPLA947和

31、柠檬明串珠菌IPLA1687）中RSM30培养的嗜温乳酪起始培养物通过菌落计数测得的生长。 图5. 乳酸乳球菌乳酸亚种和柠檬明串珠菌在培养物A（A）和培养物B（B）中不同培养时期的半定量分析。相对的可培养总数通过菌落计数计算，每个菌落的结果被表示成总 cfu ml1的百分比。相对的新陈代谢活性群体（可培养的和不可培养的）通过RT- PCR为基础的T-RFLP分析，结果表示为TRF峰面积占所有峰面积的百分数。只有峰对应141 ±1bp大小的TRF（柠檬明串珠菌）和259 ±1bp（乳酸乳球菌乳酸亚种）被考虑。（刘畅翻译）4. 讨论大部份关于应用T- RFLP监测微生物群体的研

32、究都集中于对环境样品的定量分析，但只有很少的关于这项技术的定量可行性的工作被出版（Trotha et al.,2002; Lueders 和 Friedrich，2003）。所有的作者都赞同T- RFLP应用于定量分析具有限制性，因为它受制于所有分子的方法不利因素。当处理那些微生物多样性很高并且具有多样的细胞裂解抗性（因此提取的核酸有差异）的复杂的生态系统时，这些问题变得更明显，基因组大小或 G+ C 含量也能导致差异的扩大（Suzuki 和 Giovannoni,1996; Wintzingerode et al.,1997; Suzuki et al.,1998; Marsh et al.

33、,2000）。 现阶段的工作中，我们挑选了二个相对接近的种组成一个简单的模型，因此由模板的差别扩增所引起的差异和复杂的生态系统比较起来被减到最少。尽管模型简单，非预期产物在silico 限制分析中以额外的峰的出现被显示出来，可能是16S rRNA序列特异性引起的PCR假象（Clement et al.,1998），和对应于假的TRFs峰一样。即使是分析单一培养物，这些现象也可被观察到。 这些结果显示一些问题，当处理复杂的成分未知的样品时，通常造成对微生物群体的种群数量的过高估计，因为许多这样的峰可能错误地被指定给不存在的微生物。在目前的情形，因为培养物的微生物成分完全被定义，人们可以区分什么是

34、“真的”和“假的”TRFs，这使得T- RFLP应用于这类分析成为可能。因为T- RFLP的分析以PCR扩增为基础，它便被这项技术的固有缺陷所限制。在所有能影响T- RFLP的因素之中，PCR循环数在退火过程中最重要，同样还有错配分子造成的假象以及假的TRFs（Suzuki 和 Giovannoni,1996; Wang和Wang,1997;Wintzingerode et al.,1997; Egert 和 Friedrich,2003; Suzuki et al.,1998）。所有的作者都赞同通过减少循环数将这些影响减到最小。考虑到这些，低循环数的PCR可以清楚地减少了这些干扰峰。另外地，

35、T- RFLP的分析需要有一个好的重复性。 T- RFLP分析和依赖培养的方法对混合培养物中的群体比例比较分析表现出相似的结果。在发酵末期两种方法之间观察的相对群体总数的一些不同可以用可培养的和不可培养的细胞（但是仍然具有新陈代谢活性）的存在所解释，不可培养的细胞只能通过T- RFLP分析和总rRNA的RT- PCR发现。这种方法当有些成员用传统方法监测不出来时非常有用，同时，当有来自非可见细胞DNA存在的情况下利用传统PCR扩增可能造成区域总数的高估，这种方法可以避免这种情况。（Wolffs et al.,2005）。 考虑到T-RFLP应用于复杂微生物的群体定量分析的局限性，这一工作证明它

36、可以作为一种更快的以及长效的，可作为传统方法备选的研究相对简单微生物生态系统的新陈代谢活性群体动力学的方法，同样也适用于商业的起始培养物。致谢这一工作由西班牙Ministerio de Ciencia y Tecnolog 资助（AGL2000-1611 C03-02工程）。 Jorge Ignacio Sanchez是Ministerio de Cienciay Tecnologia的 FPI 博士奖学金的接受者。参考文献1Bentsink, L., Leone, G.O.M., van Beckhoven, J.R.C.M., van Schijndel, H.B., van Gemen,

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