远场超分辨随机光重建显微镜_STORM_研究进展

1、 第1 期 王成， 等： 远场超分辨随机光重建显微镜（ STORM） 研究进展 图7 激活子报告子对构成的光可控开关探针 23 （ a） 不同光谱的报告子展现的光开关行为 。（ b） Cy3Cy5 ，Cy3Cy5 5 和 Cy3Cy7 对开关速率 Kon 和 Koff 与绿激光和红激 457 ， 532 nm 三个染料归一化激活率。 光间的关系； （ c） 相同的报告子可能被不同光谱的激活子激活 。（ d） 在三个波长 405 ， 图8 模型 DNA 样品的三色 STORM 图像 23 （ a） 显微镜切片上混合高密度的三个用 Alexa405Cy5 ， Cy2Cy5 或 Cy3Cy5 标记的

2、不同 DNA 结构三色 STORM 成像； （ b） 和（ c） 是（ a） 中方框位置放大的视图； （ d） 蓝、 绿、 红的定位分布。 STORM 成像的分辨率， 一方面要开发出量子效率更 高、 荧光更稳定、 颜色不同的荧光蛋白或荧光染料。 此外， 由于 STORM 显微镜每次定位一个荧光分子， 即在采集一幅图像时只有一个荧光位置被采集 ， 而 且为了保证足够高的定位精度， 要收集足够的光子 数量， 所以要对衍射极限内所有荧光都按照这样的 程序成像后重建出一幅完整的衍射极限内的图像 ， 所需时间较长， 大约要几分钟， 只能研究固定的或时 间分辨率要求不高的生物样品。由于生命现象是非 STO

3、RM 成像的时间分辨率是对 静止的活动的本质， 47 光 学 技 术 第 37 卷 9 Hell S W，Wichmann J Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission： stimulated emission depletion microscopy J Optics Letters， 1994 ， 19 （ 11 ） ： 780 782 10 Neil M A A，Kaitis R J，Wilson T Method of obtaining optical sectioning by using st

4、ructured light in a conventional microscope J Optics Letters， 1997 ， 22 ： 1905 1907 11 Bobroff N Position measurement with a resolution and noiselimited instrument J Review Science Instrument，1986 ，57 ： 1152 1157 12 Gelles J，Schnapp B J，Sheetz M P Tracking kinetindriven movements with nanometrescale

5、 precision J Nature，1988 ，331 ： 450 454 13 Thompson R E，Larson D R，Webb W W Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probesJ Biophysical 2002 ， 82 ： 2775 2783 Journal， 14 Yildiz A，Forkey J N， et al Myosin V walks handoverhand： single fluorophore imaging with 1 5nm localizat

6、ion J Science， 2003 ， 300 ： 2061 2065 15 Robert M Dichson， Andrew B Cubitt， et al On / off blinking and switching behaviors of single molecules of green fluorescent protein J Letters to Nature 1997 ， 388 ： 355 358 16 Irie M，Fukaminato T，Sasaki T，et al A digital fluorescent molecular photoswitch J Na

7、ture， 2002 ， 420 ： 759 761 17 Bates M，Blosser T R，Zhuang X W Shortrange spectroscopic J Physical review ruler based on a singlemolecule optical switch letters， 2005 ， 94 （ 10 ） ： 108101 108103 18 Ram S， Ward E S， Ober R J Beyond Rayleigh s criterion： A resolution measure with application to singlemo

8、lecule microscopy J Proc Natl Acad Sci 2006 ， 103 ： 4457 4462 19 Rust M J， Bates M， Zhuang W X Subdiffractionlimit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy （ STORM） J Nature 2006 ， 3 ： 793 796 methods， 20 Kao H P，Verkman A S Tracking of single fluorescent particles in three dimensions

9、： Use of cylindrical optics to encode particle posi1994 ， 67 ： 1291 1300 tion J Biophysical Journal， 21 Holtzer L，Meckel T，Schmidt T Nanometric threedimensional tracking of individual quantum dots in cells J Applied physics letters， 2007 ， 90 ： 0539021 0539023 22 Huang B，Wang W Q，Bates M，et al Stoch

10、astic optical reconstruction microscopy threedimensional superresolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy J Science，2008 ， 319 ： 810 813 23 Bates M，Huang B，Graham T，et al Multicolor superresolution imaging with photoswitchable fluorescent probes J Science， 2007 ， 317 ： 1749 16

11、55 24 Goda K，Tsia K K，Jalali B Serial timeencoded amplified imaging for realtime observation of fast dynamic phenomena J Nature， 2009 ， 458 ： 1145 1149 细胞生物学的研究最大的障碍。 因此， 当前的研究 热点集中在通过改变荧光探针和成像模式来进一步 提高超分辨成像的时空分辨率， 以便用于活细胞的 研究。要解决这个问题还有较长的路要走 。在目前 的技术手段下， 为了提高时间分辨率， 一方面可以采 用时分复用技术即在相同时刻， 同时定位不同位置 。

12、， 的荧光分子 另一方面 为了解决收集足够多的光 子数量的问题， 要开发新型的、 高通亮的光可控开关 使单位时间内激发地荧光光子数量大幅 荧光分子， 度提高， 缩短光子采集时间， 还可以采用光中继来实 24 现提高光子接收数量的问题 ， 具体方法如下： 因 为荧光信号具有一定的光谱宽度， 而且波段大多集 中在可见光和近红外波段， 采用具有全谱带放大能 力的拉曼放大对荧光光子进行放大比较理想 ， 光纤 以传输光纤作 拉曼放大器基于受激拉曼散射机制， 为增益介质， 具有增益波长由抽运波长决定， 噪声系 数低， 良好的宽带放大特性， 可以对弱荧光进行放大 提高光子输出的数量， 消除了高帧频下接收光子

13、数 量少的问题， 可以实现高时空分辨的成像。 参考文献： 1 陈宜张 近年来细胞分子研究的重要进展J 生命科学， 2008 ， 20 （ 1 ） ： 1 2 Chen Y Z Significant progress of research for cellular molecule in recently yearsJ Chinese Bulletin of Life Sciences， 2008 ， 20 （ 1 ） ： 1 2 2 Born M，Wolf E Principles of optics M 6th ed，Pergamon 1993 Press： Oxford， 3 Schn

14、echenburger H Fluorescence techniques in biomedical diagnostics： instrumentation，analysis and unresolved issues J Springer 2008 ， 6 ： 533 548 Ser Flouresc， 4 Evangelista V，Barsanti L，Passarelli V，et al From cells to proteins： Imaging nature across dimensions M Springer， Pisa， Italy， 2005 ， 209 216 5

15、 毛峥乐， 突破光学衍 王琛， 程亚 超分辨远场生物荧光成像 J 中国激光， 2008 ， 35 （ 9 ） ： 1283 1288 射极限 Mao Z L，Wang C，Cheng Y Supperesolution farfield fluorescence bioimaging： breaking the diffraction barrier J Chinese Journal of Lasers， 2008 ， 35 （ 9 ） ： 1283 1288 6 Hell S W Double scanning confocal microscopyP Europe patent， 0491289 7 Hoppe A D， Shorte S L， et al Threedimensional FRET reconstruction microscopy for an