bBMP／胶原／珊瑚复合人工骨修复股骨头骨缺损的实验研究

1、    bBMP胶原珊瑚复合人工骨修复股骨头骨缺损的实验研究        摘要目的研究用复合人工骨治疗股骨头坏死的效果。方法建立双侧股骨头内骨缺损模型，并分为4组：bBMP胶原珊瑚复合人工骨组(6侧)、肌骨瓣组(6侧)、单纯珊瑚组(2例)、对照组(14例)，为上各组的对侧。对植入后3周、16周的股骨头行病理学检查、计量组织学分析及四环素荧火标记。结果16周后，复合人工骨的骨缺损大小、缺损区骨小梁体积、荧光带宽度均与对照组有统计学显著性，但5侧中有1侧出现继发性骨关节炎。结论

2、该复合人工骨有较强的传导成骨及诱导成骨作用，是修复股骨头骨缺损的良好移植材料，但它不能改善缺血坏死股骨头的血供。该股骨头内骨缺损加用95%酒精灌注，模型近似于股骨头坏死囊性变，对于研究股骨头坏死的治疗有较大价值。关键词股骨头坏死；骨缺损；骨形态发生蛋白；珊瑚；人工骨；荧光标记Experimental Study of bBMP/Collagen/Coral Composited Bone Substitute in Repairing of Bone Defect of Femoral HeadXu Xiaoliang(Department of Orthopedics,The Second

3、Affiliated Hospital of Xi'an Medical University,Xi'an,710004.)Tong zhi qin(Department of Orthopedics,The Second Affiliated Hospital of Xi'an Medical University,Xi'an,710004.)Wang Kunzhen et al.(Department of Orthopedics,The Second Affiliated Hospital of Xi'an Medical University,X

4、i'an,710004.)AbstractObjectiveTo evaluate the effectiveness of bBMP/collagen/coral composited bone substitute in treatment of avascular necrosis of the femoral head(ANFH).MethodsAnimal model of bone defect of canine bilateral femoral heads were established.They were divided into 4 groups:composi

5、ted bone substitute group(n=6),muscle pedicle bone group(n=6),simple coral group(n=2),control group:contralateral hip(n=14).Pathological examination was studied at 3 weeks and tetracycline labelling,metrical histological analysis were studied at 16 weeks.ResultsAt 16 weeks,there were statistically s

6、ignificant differences of the size of bone defect,trabecular bone volume and width of tetracycline fluorescent zone between composited bone substitute group and control group.one of 5 cases of bone substitute group developed secondary osteoarthritis.ConclusionsThe composited bone substitute possesse

7、s a superior osteoinductivity and osteoconductivity in repairing of bone defect of femoral head,but it can't improve the revascularization of ANFH.The bone defect model of femoral head is similar to cystic change of ANFH and can be used in the study of treatment of ANFH.Key wordsFemur head necro

8、sis;Bone defect;BMP;Coral;Bone substitue;Fluorescent labelling成人股骨头缺血性坏死(ANFH)的治疗，仍是目前骨科的一大难题。作者用牛骨形态发生蛋白(bBMP)胶原珊瑚复合人工骨修复犬股骨头内骨缺损模型，行病理标本观察，计量组织学及四环素荧光标记检查，以探索用人工骨治疗股骨头坏死刮除死骨后骨缺损的新领域。1材料及方法1.1复合人工骨的制备1.1.1bBMP提取按Urist法1从小牛皮质骨中提取，冻干，4°C保存。经小鼠肌袋植入试验，证明bBMP有诱导成骨活性。1.1.2骨胶原提取取新鲜牛骨，去除骨髓及软组织，粉碎，3mM/

9、L的NaN3洗涤，1：1的氯仿甲醇脱脂，双氧水去抗原(非胶原蛋白)36 h，0.6ML的Hcl脱钙，离心，冻干备用。1.1.3珊瑚处理采自海南三亚的天然滨珊瑚(中山医科大学口腔医院提供)，加工成10mm×8mm大小，园柱状。刷洗后用5%次氯酸钠浸泡24 h，流水冲洗96 h，三蒸水超声浸洗0.5 h，烘干备用。1.1.4复合人工骨制备取bBMP60mg，溶于4M的GuHcl液4ml中，加入骨胶原300mg，摇匀使部分溶解，投入珊瑚6颗，负压抽真空，对去离子水透析(4°C)，冻干，环氧乙烷消毒备用。每颗人工骨含bBMP100mg，骨胶原50mg。1.2股骨头骨缺损模型的建立健

10、康杂种狗22只，雌14只，雄8只，系一级动物，体重11.420.0kg，平均14.77kg。参照PierreJacque2报道听方法建立股骨头骨缺损模型，并有改进。采用双侧髋外侧切口，切开大部分关节囊，在股骨头颈交界处钻洞，刮除头内50%松质骨，以95%的酒精棉球填塞并灌注30分钟。取出棉球，缝合各层结构。术后死亡3只狗。1.3骨缺损的治疗1个月后，取14只狗，随机器分4组：复合人工骨组，6只(右侧)；肌骨瓣组，6只(右侧)；单纯珊瑚组，2只(左侧)；对照组，以上各组的对侧(14条)。取原手术切口，刮除囊腔内组织及周围硬化带，分别植入复合人工骨、臀中肌大转子骨瓣或单纯珊瑚。1.4观察内容及方法

11、1.4.1病理组织学检查造模后3 d及1、2、3、4周各处死1条，植入后3周人工骨组及肌骨瓣组各处死1只，植入后16周处死12只。观察股骨头外形及冠状面结构，测囊腔大小。取股骨头前半部分作脱钙骨切片，HE染色。将植入16周的组织切片的原缺损区行计量组学分析，计算其骨小梁体积(TBV)。1.4.2四环素荧光标记植入后6、10、14周全周7d分别于饲料中加入四环素或土霉素(10周)粉剂0.5gd狗。16周末取前部行75%酒精固定，Villanueva染液染色72 h3，甲基丙烯酸甲酯(含17.5%的丁酯)包埋4，普通切片机不脱钙骨切片，片厚5um。Nikon荧光摄影显微镜观察并摄影，每个标本测量1

12、0只以上的荧光带宽度，求平均值。2结果与分析2.1病理组织学检查2.1.1造模后1个月内变化：1周，骨缺损区内有坏死组织，周围坏死带形成，厚为12mm，骨小梁内有大量空骨陷窝，骨髓坏死，外周骨髓腔充血渗出。23周，囊腔形成，壁轻度硬化，囊腔中部有肉芽组织及坏死组织，周边有软骨痂生长。4周囊腔周边有新生软骨痂及骨痂，硬化带明显。2.1.2植入后3周人工骨组，囊腔中部为珊瑚人工骨，孔隙内见纤维肉芽组织及毛细血管长入，周边为多量软骨性骨痂形成，未见淋巴细胞浸润等炎症反应，见1。肌骨瓣组，骨瓣未愈着，囊腔内少量软骨痂形成。对照组，囊腔中部为坏死组织及肉芽组织，周边有少量软骨痂及骨痂形成。囊腔硬化带明显

13、，见2。2.1.3植入后16周人工骨组：无髋关节脱位。原骨缺损5侧中3侧完全消失，内有板层状或编织状新生骨小梁生长，人工骨已吸收消失，无硬化带形成，未见有淋巴细胞浸润，见3。5侧中1侧有继发性骨关节炎改变，其余关节面光滑。肌骨瓣组：原骨缺损基本消失。5侧中有2侧发生脱位，脱位的股骨头关节面坏死，纤维组织增生，囊性变，其余关节面光滑。对照组：12例中4侧发生脱位，其中与组对照的3例，与组对照的1侧，与组对照的无脱位。未脱位者，均有囊腔残留，硬化带可见，腔内为致密结缔组织或稀疏的骨小梁或富含脂肪的骨髓，见4。8侧中2侧关节软骨粗糙磨损，软骨下见少量继发性小囊腔形成。脱位者，4侧均塌陷，关节软骨溶解

14、坏死，纤维增生及囊性变，软骨下骨变薄或消失，见5。单纯珊瑚组：股骨头脱位并坏死，软骨面塌陷，囊腔部分残留。各组每侧股骨头的囊腔总面积，见表1。2.2计量组织学分析结果见表2。2.3荧光标记、Villanueva染色结果骨小梁被染成绿色，类骨质呈棕色，骨髓呈红色。骨小梁髓腔面可见23条荧光带，由内向外分别为金黄色(四环素)、土黄色(土霉素)及金黄色。各组荧光带宽度，见表3。表1股骨头骨缺损治疗后各组囊腔大小(cm2)分组n治疗侧(±s)对照侧(±s)d±sP值人工骨组50.116±0.1650.834±0.0630.718±0.1450

15、.01肌骨瓣组50.390±0.1490.608±0.2280.303±0.2380.05注：人工骨组与肌骨瓣组比较P0.05 表2股骨头骨缺损治疗后各组原缺损区TBV分组n治疗侧(±s)对照侧(±s)d±sP值人工骨组544.82±4.0325.58±10.7019.24±13.370.05肌骨瓣组535.72±9.9423.93±5.5911.79±12.900.05注：人工骨组与肌骨瓣组比较P0.05 表3股骨头骨缺损治疗后各组荧光带宽度(m)分组n治疗侧(±

16、s)对照侧(±s)d±sP值人工骨组515.21±4.869.26±2.275.59±4.240.05肌骨瓣组517.61±4.628.69±2.388.36±5.600.05注：人工骨组与肌骨瓣组比较P0.05 3讨论3.1股骨头坏死治疗方法回顾成人股骨头缺血性坏死(ANFH)的治疗较困难，保留髋关节的手术治疗是目前研究的主要方向。ANFH早期病理改变是股骨头的缺血性改变，后期则发生股骨头塌陷。因此重建及改善缺血坏死股骨头的血供，加强对股骨头软骨下骨的支撑，促进缺血坏死区的修复重建，保存自体股骨头，防止进一步塌陷

17、是治疗的主要目标。保髋手术的方法很多，有髓心减压、骨移植5、截骨术、血管束植入、骨膜移植、骨软骨移植、记忆金属网球植入等，均取得一定疗效，但没有一种技术是完全满意的。近年来，有学者用BMP等细胞因子辅助治疗ANFH，实验研究取得较好疗效。本研究试用bBMP骨胶原珊瑚复合人工骨修复股骨头骨缺损，以研究其对ANFH区修复的效果，探索用复合人工骨治疗ANFH的新领域。3.2复合人工股的成骨作用及机理天然珊瑚的主要成份为碳酸钙，占99%，孔径150200m，孔隙率约36.5%。具有良好的生物相容性、生物降解性和骨传导性，12周可完全被吸收。有一定的抗压强度(18.4MPa)，对股骨头的软骨下骨具有支撑

18、作用。但珊瑚本身无诱导成骨作用，往往因吸收快于成骨而不利于骨缺损的修复6、7。本研究一侧单用珊瑚修复股骨头骨缺损失败也说明了这一点。bBMP是从小牛皮质骨中提取出的部分纯化酸性多肽，能诱导未分化的间充质细胞分化为成软骨细胞及成骨细胞，从而诱导骨的形成8。但单纯的bBMP在体内扩散太快，易被蛋白酶分解，又无传导成骨作用。珊瑚是bBMP的良好载体，而骨胶原易与bBMP结合，使bBMP不易扩散，且利于HA的局部沉积，故bBMP骨胶原珊瑚人工骨具有良好而持久的骨传导及骨诱导作用。Sciadini MF用bBMP珊瑚人工骨修复犬节段性桡骨缺损取得良好效果9。本研究对股骨头骨缺损用复合人工骨修复，发现其骨

19、缺损的大小、骨小梁体积、荧光带宽度均与对照组有统计学显著性，未见免疫排斥反应。说明其具有较强的修复骨缺损的作用及良好的生物相容性，是一种理想的修复骨缺损的移植材料，可试用于ANFH的刮去死骨后骨缺损的修复。3.3复合人工骨治疗ANFH的缺陷有学者研究认为bBMP具有促进血管生长的作用，但作用较弱。人工骨组中有1例发生继发性骨关节炎，说明用此复合人工骨治疗ANFH有不足之处，可能与其不能改善股骨头血供有关。故在用此复合人工骨治疗ANFH时，应同时采用改善股骨头血供的措施，以加强其治疗ANFH的效果。3.4关于股骨头骨缺损模型该模型的建立是在PierreJacque的基础上加用95%酒精灌注30m

20、in，以造成骨缺损区周围部分区域的骨坏死，并剥离大部分关节囊，致股骨头缺血，所建模型类似于ANFH囊性变，对于研究ANFH的治疗具有较大价值。股骨头脱位后，血管受牵拉痉挛闭塞，血供障碍，股骨头承受应力下降，关节软骨失去滑液的营养而变性坏死，软骨下骨板明显变薄，致生物力学强度下降，股骨头塌陷。对照组中未脱位者的囊壁硬化带形成是种代偿反应，为局部应力增加所致。但硬化带形成可产生应力遮挡，不利于囊腔闭合。如行囊腔内移植物支撑，硬化带可逐渐消失。故治疗ANFH行髓芯减压后用移植物支撑有利于骨缺损的闭合及坏死区的修复。(本文片见插页)。1人工骨组：3周，骨缺损区见较多软骨痂生长，手细血管及纤维组织长入珊

21、瑚孔隙内（空白区为珊瑚脱钙后形成）2对照组：3同，骨缺损区有较多坏死组织及肉芽组织和少量软骨痂及骨痂。囊壁硬化带明显3对照组：股骨头脱位、软骨面变性坏死，囊性变、纤维组织增生，软骨下骨变薄或消失4人工骨组：16周，原骨缺损内见大量的编织骨及板层骨形成（HE）5对照组：16周，原骨缺损区内见较多的坏死骨小梁碎片及脂肪性骨髓（HG）徐晓良（西安医科大学第二附属医院 西安市 710004）同志勤（西安医科大学第二附属医院 西安市 710004）王坤正（西安医科大学第二附属医院 西安市 710004）牒军（西安医科大学第二附属医院 西安市 710004）党晓谦（西安医科大学第二附属医院 西安市 710004）徐德洪（西安医科大学第二附属医院 西安市 710004）高明宏（西安医科大学第二附属医院 西安市 710004）参考文献1，Urist MR,Huo YK,Brownell AG et al.Purification of bovine bone morphogenetic protein by hydroxy