玉米肽抗疲劳作用的实验研究

1、营养卫生食品科学2004, Vol. 25, No. 9173玉米肽抗疲劳作用的实验研究昌友权（吉林工程技术师范学院生物与食品工程系，吉林长春）摘要：目的：为了开发、利用玉米肽资源、对玉米肽进行了抗疲劳作用研究。方法：进行玉米肽对小鼠游泳时间、小鼠爬杆时间、血乳酸、血中尿素氮、肝糖原含量和肌糖原含量等的影响实验。结果：玉米肽能增强小鼠游泳耐力、延长爬杆时间，降低血乳酸、血中尿素氮含量，提高肝糖原含量和肌糖原含量。结论：玉米肽具有抗疲劳作用。关键词：玉米肽；抗疲劳（，）：，：；中图分类号：文献标识码：文章编号：（）玉米肽是以玉米蛋白粉为原料，在碱性蛋白酶催化下，进行部分水解，经过离心、层析等手段

2、进行分离纯化，然后进行喷雾干燥，得到的低分子量的寡肽混合物。其分子量一般在以下。目前的研究发现：玉米肽可促进乙醇代谢；抗疲劳作用；由于玉米肽中富含支链氨基酸，因此玉米肽还具有在肌肉中促进蛋白质合成和抑制蛋白分解的功能；在非常情况下可以直接向肌肉提供能量；另外，关于玉米肽降血压、降血脂、治疗乳腺癌的研究也在进行。本文研究发现玉米肽具有良好的抗疲劳保健功效，为玉米肽的开发应用提供理论依据。疲劳（）是机体复杂的生理生化变化过程。年第五届国际运动生化会议对疲劳概念的定义为：“机体生理过程不能将其机能持续在一特定水平或器官不能维持其预定的运动强度。”由于运动引起机体生理生化改变而导致机体运动能力暂时降低

3、的现象，被称为运动性疲劳。疲劳是防止机体发生威胁生命的过度机能收稿日期：基金项目：吉林省教育厅资助项目（吉教合字第号）衰竭而产生的一种保护性反应，它的产生提醒工作者应减低工作强度或终止运动以免机体损伤。本实验是通过小鼠游泳试验、爬杆试验以及相应的生化指标：血尿素、血乳酸、肝糖原和肌糖原及脑内谷氨酸（）和氨基丁酸（）含量变化对玉米肽进行抗疲劳功能的研究。材料与方法实验动物昆明种雄性小鼠，周龄，体重。将小鼠随机分为组，每组只，组间体重经检验无显著差异。对照组、低剂量、中剂量组和高剂量组，饲养受试物量分别对应为：、和的玉米肽，对照组给同体积的蒸馏水。每体重给药。采取灌胃法，连续给予受试物后，测定各指

4、标。药品与试剂公司；）174 2004, Vol. 25, No. 9食品科学营养卫生公司；强酸型阳离子交换树脂；强酸型阳离子交换树脂；碱性蛋白酶公司；玉米蛋白粉公主岭市蛋白加工厂，蛋白含量；谷氨酸和氨基丁酸公司；丹酰氯公司；尿素氮测定试剂盒（二乙酰一肟法）北京化工厂。其他试剂均为国产分析纯，水为双蒸水。仪器型冷冻干燥机；超滤器；调至，加入一定量的碱性蛋白酶，于水浴振荡水解确定反应时间。其间，每隔测一次值，并用溶液中和使保持。反应终点，用沸水煮沸灭活。玉米肽的制备基本流程见图。玉米肽的分离纯化分离纯化流程见图。玉米肽混合物（玉米蛋白水解产物）超滤残液滤液分子筛凝胶柱层析峰，峰离子交换柱层析峰峰

5、峰峰分子筛柱层析，除盐峰峰小肽小肽图玉米肽的分离纯化流程Fig.3 Isolation of antioxidative corn-peptides；高效液相色谱仪（）；电喷雾质谱仪瑞典公司；超速离心机（康强，意大利）；分光光度计。玉米醇溶蛋白的制备玉米蛋白粉的前处理粉碎、过目筛。制备流程见图。玉米蛋白粉异丙醇水溶液（含）水浴振荡离心残渣上清过夜上清液醇溶蛋白晾干玉米醇溶蛋白粉图玉米醇溶蛋白的制备Fig.1 Preparation of prolamin分离纯化操作要点超滤玉米肽的制备将玉米蛋白和适量水混合，用溶液醇溶蛋白蒸馏水调保持加入溶液，浑浊液碱性蛋白酶水浴煮沸，灭活离心超滤膜的处理将超

6、滤膜用的稀碱液浸泡，清水冲洗，反复操作几次，或者将超滤膜装上，加压超滤冲洗，以除去叠氮化钠等物质。样品：水解物离心（），去沉淀，得上清液，加水稀释至，以氮气加压，超滤，将滤液冻干，产物密封保存。分子筛层析将超滤液冻干样品上柱，洗脱，洗脱液为醋酸水溶液，流速，上样次。在波长处检测其光吸收，收集各洗脱峰。将洗脱峰液体冻干，以备下一步分离。离子交换柱层析取上步所得峰的冻干样品，用柠檬酸起始缓冲液溶解上样，进行阶段洗脱，洗脱液为柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液（分别为、）在波长处检测，收集洗脱各峰用茚三酮法和双缩脲法检测各峰，以待下一步分离。残渣上清超滤超滤液玉米肽混合物图玉米肽的制备流程图Fig.2 Prep

7、aration of corn-peptide营养卫生食品科学表洗脱条件Table 1 Elution requirement of HPLC2004, Vol. 25, No. 9175滞留时间峰面积峰面积（）（）峰高峰类型洗脱条件：乙腈醋酸：三氟乙酸时间：成分：除盐泳之后、的小鼠眼内眦静脉丛取血。于离心管中加入溶液，准确吸取全血加入试管底部。用试管上清液冲洗微量吸管数次，再加入蛋白沉淀剂，振荡混匀，离心，取上清液测定。肝糖原的测定末次给予受试物后，将小鼠放于水温±的水中游泳后停止，立即处死小鼠取出肝脏，精确称取，加入，每管匀浆，离心，取上清液转移至另一试管内。在沉淀中加入。匀浆，

8、再次离心，取上清液，与第一次离心的上清液合并，充分混匀。取上清液，每管加入的乙醇，充分混匀至两种液体间不留有界面。室温放置过夜。沉淀完全后将试管于离心。小心倒掉上清液并使试管放置，用蒸馏水振荡溶解后测定。肌糖原的测定末次给予受试物后，将小鼠放于水温±的水中游泳后停止，立即处死小鼠取出肌肉，以溶液冲洗后，用滤纸吸干，准确称取肌肉，放入盛有的试管中，置沸水浴煮，取出冷却后，将其转移至容量瓶中，用水多次洗涤试管，一并收入容量瓶，加水至刻度，摇匀待用。置沸水浴中，冷却后在波长处测量光吸收值，空白管调零点。小鼠脑内和含量的柱前衍生梯度洗脱反相测定脑组织加蒸馏水后超声匀浆加入高氯酸，离心，取上清

9、液，滴加调置。加入丹酰氯丙酮，加热反应后，滴加终止将上步的缓冲液洗脱所得峰冻干产物，用凝胶柱，用水洗脱，除盐。析和制备条件：惠普型；色谱柱：，（）；柱长：；波长：；流速：（）；浓度：；上样量：。流动相：见表。小鼠体力性疲劳模型的制备游泳试验末次给予受试物后，给小鼠负体重重量，将小鼠放于水深不少于，水温±的游泳箱中。记录自游泳开始至头部全部沉入水中不能浮出水面的时间作为小鼠游泳时间。爬杆试验末次给予受试物后，将小鼠放在爬杆架的有机玻璃棒上，使其肌肉处于紧张状态，记录小鼠由于肌肉疲劳从有机玻璃上跌落下来的时间。第三次跌落时终止实验，累计三次的时间作为爬杆时间。血尿素的测定末次给予受试物后

10、，将小鼠放于水温±的游泳箱中游泳，休息后摘眼球取血，取血清用试剂盒（二乙酰一肟法）测定。血乳酸的测定末次给予受试物后，将小鼠放于水温±的水中负重游泳停止，分别从游泳前、游高效液相层析及纯度检测将分离得到的小肽分别溶于去离子水进行分176 2004, Vol. 25, No. 9食品科学营养卫生反应，离心，取上清液进行测定。数据处理使用统计软件对实验数据进行统计分析。结果与讨论玉米肽的制备是肽类，可能是玉米色素，其余两峰含量低，为白色粉末，也有抗氧化性，但产率较低，无应用价值，故将确定为下步分离的对象，进行进一步的分离纯化。离子交换柱层析将上一步分离所得的峰洗脱液经冻干浓缩后

11、走（型）离子交换柱，用柠檬酸磷酸缓冲液进行分段洗脱，得如图结果。在玉米醇溶蛋白水解制备小肽的过程中，选用了碱性蛋白酶（一种丝氨酸蛋白酶），由于其专一性不强，可将蛋白水解成分子量较小的肽。该碱性蛋白酶的最适为，最适反应温度为。反应时水浴振荡，使酶与底物充分接触并保持恒温。反应过程中，由于蛋白不断水解释放出多肽和氨基酸，总体使溶液值下降，为了保持酶的最适，定时用溶液滴定，回调至起始值。玉米肽的分离纯化超滤将酶水解产物经分子量的超滤膜超滤，所得滤液冻干，以邻苯三酚自氧化法进行抗氧化性测定，产物抗氧化活性与原水解液冻干产物相比，发现其活性显著提高。故选择超滤产物作为下一步分离纯化的对象。分子筛凝胶柱层

12、析所超滤得到的产品仍为小肽混合物，首先利用分子量的差异用分子筛粗分，将此混合物利用凝胶柱层析进行分离，得到分子量大小不同的五个峰，如图所示。图离子交换柱层析图谱Fig 5 Elution profile of CP fraction by steped ionexchange chromatography由图可见，分离所得组分主要集中在峰（时的洗脱峰，为上柱洗脱的柱前峰，未能吸附上的组分），峰（时的洗脱峰）和峰（的洗脱峰）和峰（时的洗脱峰）中，冻干，均为白色粘滞状固体。其中，峰的产率较其他三峰高，且除盐后活性较强，故决定取峰进行进一步分析。除盐与检测将峰洗脱液冻干浓缩后，利用分子筛凝胶层析除盐

13、，得到如图结果。（）时间（）色谱柱：（×）；移动相：醋酸；流速：（×）图分子筛凝胶柱层析图谱Fig.4 Elution profile of CP fraction by size exclusion图除盐与检测图谱Fig.6 Elution volume各个峰洗脱液收集冻干，产物分别进行抗氧化活性测定，峰部分为柱前峰，具有一定的抗氧化活性，为白色絮状物，峰的活性高于其他峰，而且，峰的产率较高，为白色絮状物，峰为暗绿色物质，不制备用惠普型制备型色谱柱，分离各组分。谱图和分析图相似，收集富集产物，冻干。玉米肽对小鼠游泳时间、爬杆时间、血清尿素营养卫生食品科学2004, Vol

14、. 25, No. 9177表玉米肽对小鼠游泳时间、爬杆时间、血清尿素氮、肝糖原和肌糖原含量的影响（±）Table2 Corn-peptide's effect on the time of swimming and climbing pole of mice and the content of plasm a urea, liverglycogen, muscle glycogen组别小鼠数对照组低剂量组中剂量组高剂量组注：与对照组相比较，；：，。游泳时间（）±±±±爬杆时间（）±±±±尿素氮

15、含量（）±±±±肝糖原（肝脏）±±±±肌糖原（肌肉）±±±±Table 3 Corn-peptide's effect on the lactates of mice ）组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组±±±±注：与对照组相比较，；：，。小鼠数游泳前±±±游泳后±±±游泳后±±±游泳后±±±（）（），中剂量组

16、爬杆时间提高了（），高剂量组爬杆时间提高了（）。实验组与对照组相比，高剂量组尿素氮含量降低了（），中剂量组降低了（）。中剂量组肝糖原含量为对照组的倍（），高剂量组肝糖原含量为对照组的倍（），结果见表。玉米肽对小鼠血乳酸含量的影响高剂量组游泳后和实验组与对照组相图制备图谱Fig.7 Elution volume比，血乳酸含量分别降低了（）和（），并且趋于游泳前的乳酸含量，结果见表。玉米肽对小鼠脑中和的影响脑内谷氨酸和氨基丁酸含量中剂量组和高剂量组均高于对照组（），结果见表。讨论总结出了一条简便而有效的肽分离纯化途径，包括氮、肝糖原和肌糖原含量的影响实验组与对照组相比，高剂量组游泳时间提高了（），

17、中剂量组游泳时间提高了（）。实验组与对照组相比，低剂量组爬杆时间提高了178 2004, Vol. 25, No. 9表玉米肽对小鼠脑中和的影响食品科学营养卫生含量中剂量组和高剂量组均高于对照组，显示玉米肽不仅能提高抑制性氨基酸（氨基丁酸）含量同时也能提高兴奋性氨基酸（谷氨酸）。以上实验数据提示，玉米肽有利于清除体内的运动时葡萄糖无氧酵解产生的大量乳酸，从而可以迅速消除疲劳，动物实验也说明了这一点。玉米肽具有调整体内代谢和快速加强体质恢复的作Table 4 Corn-peptide's effect on the GLU and GABA inthe brain of mice对照组低

18、剂量组高剂量组±±±±±±±±中剂量组注：与对照组相比较。用。玉米肽的研究为中医药抗体力性疲劳领域提供了的药理学依据。结论：。超滤、分子筛层析、离子交换柱层析、除盐层析、等步骤，具有普遍意义，可以作为小肽纯化的常规方法。凝胶层析：将小肽按分子量大小分离，并与氨基酸分离开，使组分初步纯化。离子交换层析：将分子量相近的小肽通过不同电荷性质分离，得到酸性、中性和碱性组分，使目的组分进一步纯化。除盐层析：将小肽与盐分分开，以便通过高效液相层析检测其纯度。高压液相层析：一种灵敏度较高的分析方法，检测发现我们分离得到的三个组分中有两个是单峰。结合氨基酸分析和质谱分析，采用对肽键的解析方法，我们得到该玉米抗疲劳化肽的一级结构为：，确定此肽的分子量为。在运动中，机体运动能力的降低是由于体力性疲劳的出现所致，因而延缓体力性疲劳的出现无