阪崎肠杆菌研究进展_梁鹰

1、 【 收稿日期 】 2008204203【 作者简介 】 梁鹰 (19572 , 男 , 工商管理碩士 , 副主任技师 , 从事微生物检验 文章编号 :10052376X (2008 0420418203【 综 述 】阪崎肠杆菌研究进展梁鹰 , 王红戟(台州市路桥疾病预防控制中心 , 浙江 台州 318050 【 摘要 】 阪崎肠杆菌属肠杆菌科肠杆菌属 , 是人和动物肠道内寄生的一种革兰阴性无芽胞杆菌 , 属条件致病 菌 , 能引起严重的新生儿脑膜炎 、 小肠结肠炎和菌血症 , 死亡率高达 50%以上 。阪崎肠杆菌耐酸 、 耐高温 、 耐干燥 , 对外界环境有较强的抵抗力 。 阪崎肠杆菌的微生

2、物学检验方法 , 包括传统细菌学培养方法及各种基于聚合酶链反 应 (PCR 的分子生物学方法 。【 关键词 】 阪崎肠杆菌 ; 条件致病菌 ; 微生物学 ; 检验方法【 中图分类号 】 R378. 2 【 文献标识码 】 AResearch progra ssi n g of En te robacte r sakazak iiL I A NG Ying,WANG Hong 2jie(Taizhou C ity L uqiao D istrict Center for D isease Control and Prevention, 318050, 【 Abstract 】 Enterobac

3、ter sakazakii (E . sakazakii is a me the Enter ily Enterobac 2teriaceae , which is a kind of gra m 2negative and non 2s pore bacillus al . It is a condi 2ti oned pathogen and can cause severe neonatal meningitis, ia . rates fr om E . sakazakii in facti on have been reported t o be higher than 50%.E

4、. t o high temperature, acid and dry envir on ment . The main m icr obi ol f includes conventi onal cultural methods andvari ous molecular bi ol ogical PCR.【 Key words 】 icr oorganis m; Detecti on method 是人和动物肠道内寄, , 一直被 称为黄色阴沟杆菌 Pig mented Enterobacter cloacae 1, 直到 1980年才由 F AR MER 和他的同事 2更名为阪崎肠杆

5、菌 。 因阪崎肠杆菌是肠道正常菌群中的一种 , 属条件致病菌 , 一直未被临床引起重视 , 直到 1961年 , 英国的 UR ME NYI 和FRANK L I N 3两位医生首次报告了由该菌引起的两例脑膜炎 病例 , 随后丹麦 、 美国 、 荷兰 、 希腊 、 冰岛 、 比利时等国家相继报 道了新生儿阪崎肠杆菌感染事件 。 阪崎肠杆菌能引起严重的 新生儿脑膜炎 、 菌血症和坏死性小肠结肠炎 , 并可能遗留严重 的神经系统后遗症 , 死亡率 20%50%2。国外文献报道最 多的是阪崎肠杆菌污染了婴儿配方奶粉 , 引起婴幼儿感染 。 也有几例成年人感染病例的报告 4。 阪崎肠杆菌分离检测方 法

6、 , 国际上通常以美国 F DA 2002年 8月发布的“ 婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的分离计数 ” 作为经典方法 5, 在此基础上 做了较多的改良方法及分子生物学检测方法 。 我国也与 2005年 8月颁布了奶粉中阪崎肠杆菌检测方法 6。 临床上对阪崎 肠杆菌的病原学检测方法报告较少 。 本文就阪崎肠杆菌的主 要微生物学特性 , 致病性 , 分离检测作一综合性介绍 , 以飧读 者 。 1 阪崎肠杆菌微生物学特性 1. 1 形态染色 阪崎肠杆菌属肠杆菌科肠杆菌属 , 因此本菌 具备肠杆菌基本形态特征 :革兰阴性粗短杆菌 , 细胞大小为 (0. 61. 1 ×(1. 23. 0 , 有周

7、身菌毛 , 无芽胞 , 有动力 7。 1. 2 培养特性 1. 2. 1 营养要求 不高 , 能在普通营养琼脂 、 血平板 、 麦康凯 (MAC 琼脂 、 伊红美兰 (E MB 琼脂 、 脱氧胆酸琼脂等多种培 养基上生长繁殖 。 1. 2. 2 培养温度 阪崎肠杆菌具有耐热及耐寒性 , 在外界环 境中比其他肠道杆菌生存率强 , 培养最佳温度 2536 , 在 645 下都能生长 , 某些菌株可在 47 下生长 8。 1. 2. 3 菌落特征 在胰蛋白胨琼脂 (TS A 、 脑心浸液琼脂 (BH I 及血平板上经 2536 培养 24h 后 , 形成 1. 52. 5mm, 黄色菌落 1, 菌落

8、形态有 2种 :一种为典型的光滑型菌 落 , 极易被接种环移动 , 另一种为干燥或粘液样 , 周边呈放射 状 , 不易被接种环移动 , 似橡胶状有弹性 。 后一种经传代后可 转化为有光泽的菌落 7。 1. 2. 4 菌落颜色 阪崎肠杆菌在 MAC 琼脂上为无色透明菌 落 , 在 TS A 及 BH I 上生长为黄色菌落 , 在结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂 (VRBG 能产生紫红色菌落 , 而在 TS A 上加 52溴 242氯 2吲 哚 22D 2吡 喃葡萄苷 (X2G LC 仅阪崎肠杆菌能产生兰 绿色菌落 , 现已作为阪崎肠杆菌快速培养的选择性培养基 9,在 42甲 基 2伞 形酮 22D 2

9、葡 萄糖苷 (NA +2MUG 培养基上产 生荧光菌落 10。 1. 3 生化反应 阪崎肠杆菌在定名前一直被伯杰 1分类为 产黄色素的阴沟肠杆菌 , 实际上是阴沟肠杆菌的一个亚种 , 因 此与阴沟肠杆菌的生化反应有许多相似的地方 。阪崎肠杆菌 与阴沟肠杆菌有 31%49%的 DNA 序列同源性 , G +C 含量 为 57%2。MUYT JE NS 等 11在对 226株 (其中 129株为阪崎肠杆 菌 , 其他为阴沟肠杆菌 60株 , 产气肠杆菌 19株 , 聚团肠杆菌 18株 肠杆菌的研究中 , 发现阪崎肠杆菌和其他肠杆菌之间 存在两个主要的不同 :阪崎肠杆菌 2葡 萄糖酶苷活性均阳性 ,

10、 而缺乏磷酰胺酶活性 。由此认为 , 凭两种酶活性检测可将贩 崎肠杆菌与其他肠杆菌明显地区分开来 , 并且将 2葡 萄糖酶 苷活性检测可用来快速分离阪崎肠杆菌 。P OST UP A 12研究了从婴儿配方奶粉中分离到的 6株阪 崎肠杆菌 , 发现所有的菌株都能产生吐温 280脂酶 。因此 , 吐 温 280脂酶活性测定也可以作为阪崎肠杆菌的鉴定依据 。 1. 4 抵抗力 1. 4. 1 耐高温 、 干燥 、 渗透压 阪崎肠杆菌比其他肠杆菌耐高温 , LEHNER 13研究发现阪崎肠杆菌在婴儿配方奶粉中 60 存活 2. 5m in, 并且 72 仍能存活 。 BREE LLW ER 等 8观

11、察阪崎肠杆菌在 58 下能持续 0. 390. 60m in 不死 。 由于 阪崎肠杆菌细胞内含有大量的海藻糖酶 , 累积有大量的海藻 糖 , 使得阪崎肠杆菌比沙门菌和其他肠杆菌更耐受渗透压和 干燥 。 因阪崎肠杆菌这些特性 , 使得奶粉生产时不易被杀灭 , 储存时易生存下来 。1. 4. 2 耐酸性并对清洁剂和杀菌剂有较强抵抗力 LEH 2NER 13的实验表明 , 阪崎肠杆菌能在 pH 0. 92下存活 (胃 部的酸性环境 , 可能与阪崎肠杆菌周身菌毛结构有关 , 该菌 毛结构易使细菌形成共生集合体 , 也易粘附在各种物体表面 形成一层生物保护膜 , 对清洁剂和杀菌剂具有较强的抵抗力 。

12、2 阪崎肠杆菌临床意义阪崎肠杆菌可引起各年龄段人群的疾病 , 但从已报道的 病例年龄分布来看 , 婴幼儿 (1岁以下的儿童 是该菌感染的 高危人群 , 特别是新生儿 、 早产儿 、 出生体重偏低 、 免疫力低下 等身体状况较差的婴儿 。 感染主要引起脑膜炎 、 脓毒血症 、 坏 死性小肠结肠炎 ; 阪崎肠杆菌引起的脑膜炎常引起脑梗塞 、 脑 脓肿和脑室炎等併发症 , 并且可引起神经系统后遗症 , 死亡率 较高 。 成人主要是引起局部感染和菌血症 。 2. 1 致病因素 文献对阪崎肠杆菌的致病因素报道不多 , 所814Chinese Journal ofM icr oecol ogy, Aug

13、2008, Vol 120No 14 知甚少 。 目前所知阪崎肠杆菌致病性与类肠毒素和内毒素有 关 。 P AG OTT O 14首先描述阪崎肠杆菌可能产生一种毒力因 子 类肠毒素样化合物 , 经腹腔注射板崎肠杆菌剂量达 108CF U /只时 。 18株实验菌株均可导致乳鼠死亡 , 其中 4例 检测到类肠毒素样化合物 。 国内许龙岩等 15观察小鼠在接 种阪崎肠杆菌菌液 6小时后出现中毒症状 , 8小时后中毒症 状加深 , 24小时后全部死亡 。经解剖发现实验鼠小肠肿胀 , 有气泡 , 肠壁变薄 、 糜烂 , 肠系膜血管 、 腹膜血管变粗 、 充血 。最近 , T OWNSE ND 16等发

14、现婴儿配方奶粉中含有细菌脂多 糖 内毒素 (LPS , 具有热稳定性 , 能增加小肠上皮细胞通 透性 , 促使细菌侵入肠壁中而致病 。他将纯化的肠杆菌属脂 多糖与阪崎肠杆菌一起经注射入乳鼠腹腔中 , 能明显提高阪 崎肠杆菌穿透血脑屏障的能力 , 该实验虽未明确表明阪崎肠 杆菌产生内毒素 , 但推测阪崎肠杆菌的致病性与细菌内毒素 有明显的关联 。MANGE 等 17通过体外组织细胞培养实验观察到阪崎肠 杆菌对人类上皮细胞和脑微血管内皮细胞有吸附粘连特性 , 并形成丛生 , 表面形成生物保护膜 。KI M 等 18支持上述实验结果 , 他们利用不锈钢管 、 玻璃 管及 P VC 塑料管腔内壁 ,

15、只要有一定营养液和适宜温度 崎肠杆菌就可以在这些管腔内吸附生存 , , 抵御消毒剂等的杀伤作用 。 2. 2 所致疾病2. 2. 1 FRANK L I N 等 3首 次报道了 2(杆菌 , 起的婴幼儿脑膜炎 1983年 MUYT JE NS 等 19对荷兰地区 6年来发生的 8例阪崎肠杆菌引发的婴幼儿脑膜炎作了回顾性 调查分析 。 发现未足月出生的新生儿占 75%, 出生时低体重 (<2000g 的新生儿易感染 (6/8 , 并与人工喂养奶粉有关 。 主要症状 :发热 、 面色苍白 , 有抽搐或颤抖 , 张力亢进 , 囱门隆 出 , 无颈项强直 。 合併有菌血症者占 5/8,坏死性小肠

16、结肠炎 占 2/8,死亡率高达 75%(6/8 。 2例存活的病人中伴有严重 的神经系统后遗症 。 在大部分病例的脑脊液和血液中分离到 阪崎肠杆菌 。 B iering 等 20在 1989年报告了 3例住在冰岛首 都国立大学附院新生儿重症监护室病人 , 1例正常出生但伴 有左脑损伤 , 1例是 Down s 综合症 (先天性无肛门 , 另 1例 为健康的男性双胞胎之一 , 他们共同特征是人工喂养婴儿配 方奶粉 5天后发病 , 出现发热 、 精神萎靡 、 嗜睡 、 脑脊液可见大 量的嗜中性粒细胞 , 培养分离均找到阪崎肠杆菌 , 除 1例死亡 外 , 1例发 展 为 四 肢 瘫 痪 、 痴 呆

17、 , 另 1例 为 阵 发 性 癫 痫 病 。BOW E N 等 21分析 46例阪崎肠杆菌感染的病例 , 其中脑膜炎 的发病率是 72%(33/42 , 在 33例的脑膜炎病例中有 33%发 展为癫痫 , 21%有脑脓肿 , 死亡率 42%。2. 2. 2 新生儿菌血症 该病例最早报告的是在 1979年 ,MONROE 22发现一出生 6天 (体重 2600g 的患儿出现低热 (38. 3 、 寒颤 , 白细胞偏低 , 其血液培养分离到阪崎肠杆 菌 , 经氨替比林治疗后痊愈 , 未发生脑膜炎 。阪崎肠杆菌感染新生儿发生的菌血症 , 据 BOW E N 21对 46例该菌感染的新生儿分析 ,

18、其发病率是 38%(12/42 。多 数症状较轻 , 如出现严重的脓毒血症 , 死亡率可达 36%。 2. 2. 3 新生儿坏死性小肠结肠炎 (NEC ACKER 等 23报 告了比利时一家医院的新生儿重症监护室在 1998年 67月 间共有 12例阪崎肠杆菌引起的 NEC 暴发事件 , 12例 NEC 都 经临床确诊 , 这些患儿的特点是 :均未足月出生 , 体重全部低 于 2000g, 最低体重 590g, 平均体重只有 1177g, 人工喂食奶 粉 。 胃液分离到阪崎肠杆菌 7例 (7/12 , 肛指液分离到 9例 (9/12 , 血液分离到 4例 (4/12 , 死亡 2例 (2/12

19、 。 2. 2. 4 成人感染 阪崎肠杆菌引起成人感染的报告虽不很 多 , 但从现有资料看涉及到成人各年龄段都有发生 。本菌是 条件致病菌 , 当机体因其他疾病导致免疫功能低下时 , 可引起 菌血症 、 脓毒血症及泌尿道 、 呼吸道 、 创伤面感染 , 也可引起脑膜炎 、 胆囊炎 。 周庭银 24等报告的 3例阪崎肠杆菌感染其中 败血症 1例 (女 , 45岁 , 尿路感染 1例 (女 , 55岁 , 中耳炎 1例 (男 , 21岁 。 龚燕等 25报告从 64例痰液中分离到阪崎肠 杆菌 , 其中有 62例 (96. 7%患有基础疾病 :慢性阻塞性肺疾病 24例 , 呼衰 7例 , 糖尿病 6

20、例 , 肺结核 2例 , 肺癌 2例 , 近期化疗 8例 , 肠梗阻 2例 。 最近 , See 等 26报告一个 75岁老妇患 多发性脾脓肿合併阪崎肠杆菌菌血症 。 3 阪崎肠杆菌微生物学检验 3. 1 细菌学分离培养方法 3. 1. 1 经典方法 所谓经典方法 , 即是美国 F DA 推荐 5的 “ 三管法 ” 培养分离阪崎肠杆菌的方法 。基本步骤如下 :(1 以无菌称取 100、 10、 1g 婴儿配方奶粉用无菌蒸馏水以 1 10稀释 , 充分溶解后 36 24h 孵育 ; (2 充分混匀后分别取 10m l 加入至装有 90m l EE 肉汤增菌培养 36 24h; (3 充分混 匀后

21、用直接涂布法或直接划线接种法 , 在 VRBG 平板中孵育 36 24h; (4 从每个 VRBG 平板中挑取 5个可疑菌落 , 分别 接种在 TS A 平板 25 4872h; (5 在 TS A 平板上挑取黄 色 、 无光泽典型菌落在 AP I 20E 进行鉴定 。 该方法自 2002年 被推荐公布以来 , 方法 , 缺点是时间太长 , 需时 7。3. 1. 2 改良法 G LC 11 该法是利, 在 TS A 培养基52吲 哚 2D 2(XG LC 作为发色 , (I 琼脂 。 该法的原理是 葡释放糖苷配基 52溴 242氯 2吲 哚 , 该糖苷2氯 2吲 哚 , 使菌落呈现特异性蓝绿

22、。 该改良法已被广泛应用 , 相对经典方法能缩短时间 2天 左右 , 且特异性高 9。 3. 1. 3 改良法 :荧光选择性鉴别培养基法 10该方法也是 利用 2葡 萄糖苷酶活性的检测方法 。 在营养琼脂基础上添加42甲 基 2伞 形酮 22D 2葡 萄糖苷 (2MUG 。阪崎肠杆菌在该培养基上形成黄色菌落 , 在紫外光照射下发生荧光 。该法灵敏 度和特异性都比较好 , 已在多个国家开展使用 , 均取得稳定可 靠的结果 。 3. 1. 4 改良法 :对硝基酚光电比色法 27 利用阪崎肠杆菌 的 2葡 萄糖苷酶活性 , 分解对硝基酚 22D 2葡 萄糖苷底物 , 释 放黄色的对硝基酚 , 在 4

23、05n m 波长下测定吸光度 , 根据吸光 度的大小 , 确定样品中阪崎肠杆菌是否存在 。方法是常规增 菌 , 在 VRBG 或 TS A 平板上挑取可疑菌落 , 制备成一定浓度的 菌悬液与底物混匀 , 37 4h 后进行比色测定 。 3. 1. 5 阳离子磁性珠快速捕获法 28 MULLANCE 等设计了 革兰阴性杆菌捕获系统 , 能快速富集阪崎肠杆菌 。他将普通 珠子经过顺磁化后 , 使其表面带有阳离子 (正电荷 , 能极强 地吸附带有阴离子 (负电荷 的物质 ; 革兰阴性杆菌表面的脂 多糖就是带阴离子 (负电荷 的物质 , 故阳离子磁性珠能捕获 含有脂多糖的革兰氏阴性杆菌 。 MULLA

24、NCE 将该系统设计 成自动化 , 即将婴儿配方奶粉溶解后 , 通过管道输送至捕获 器 , 反复与磁性珠接触 , 使阪崎等革兰阴性杆菌被吸附在磁性 珠表面 , 然后在蛋白胨缓冲液中洗脱细菌 ; 整个过程在 6h 内 完成 。 然后将浓缩的菌液划线 , 接种在选择性显色培养基 (DF I 或通过 PCR 分子生物学方法鉴定 。使用该方法 , 最多 在 48h 内鉴定出阪崎肠杆菌 , 比美国 F DA 经典方法缩短 5天 左右 , 并且灵敏度很高 , 可检出 15CF U /500g奶粉 。 3. 2 分子生物学方法3. 2. 1 PCR 方法 I V ERSE N 等 29利用 16S DNA

25、基因序列 的 PCR 方法 , 对 126株被 AP I 20E 和 I D 32E 自动化鉴定为阪 崎肠杆菌 , 其中有几株是 ATCC 的标准菌株 , 进行了核苷序列 分析 。 发现阪崎肠杆菌与柯氏枸橼酸杆菌最接近 , 有 97. 8%同源 , 而与阴沟肠杆菌只有 97%同源 ; 利用 16S DNA 核苷序 列分析 , 可将 126株阪崎肠杆菌进一步分为四个亚群 :与标准 菌株相比 , 有 0. 1%1. 2%序列不同的分为 群 , 共有 110株 ; 有 1. 6%1. 9%序列不同分为 群 , 共有 9株 ; 有 97. 5%97. 8%同源分为 群 , 包括分类为 Pyrinus

26、肠杆菌 、 霍氏肠 杆菌和柯氏枸橼酸杆菌 , 共有 5株 ; 第 群仅 2株 , 只有 96. 5%同源性 。LEHNER 等 30则采用针对 16S r RNA 基因序列的 PCR 方 法 。 他们对 47株不同来源的阪崎肠杆菌和 28株其他肠杆菌 进行了分析 , 经与基因库标准菌株对比 , 47株阪崎肠杆菌有 99. 4%100%同源性 , 28株非阪崎肠杆菌则全部阴性 , 特异 性很强 , 灵敏度可达 10pg 。MANOJ 等 31设计了针对阪崎肠杆菌外膜蛋白 A 基因 (OmpA 序列的 PCR 方法 , 所设计的产物能特异性地扩增阪914中国微生态学杂志 2008年 8月第 20卷

27、第 4期崎肠杆菌的 DNA 片段 , 扩增产物为 469bp 。 OmpA 基因是阪 崎肠杆菌具有的独特性位点 , 其他 G 肠道杆菌无此基因 。因 此 , 该 PCR 方法特异性非常高 , 检测灵敏度在婴儿配方奶粉 直接检测可达 103CF U /ml, 如通过 8小时培养则可 达 1021 CF U /ml, 是一种理想的快速检测阪崎肠杆菌的方法 。3. 2. 2 定量 PCR 方法 定量 PCR 是在一般 PCR 法基础上 发展起来的一种分子生物学定量方法 。 目前国内外最常使用 的是实时荧光定量 PCR 技术 (real 2ti m e PCR 。 最早使用该技 术是上个世纪 90年代

28、美国 PE 公司开发的 Taq man 荧光探针 定量技术 , 称经典方法 。之后在此基础上发展出了杂交探针 法 , 以及荧光引物法等 。 荧光定量 PCR 技术的基本原理是在 PCR 反应体系中加入荧光基团 , 该基团是一对合适的荧光物 质 , 可以构成一个能量供体和能量受体对 , 其中供体的发射光 谱和受体的吸收光谱重叠 , 在 PCR 反应基因扩增时 , 激发供 体而释放的荧光能量正好被受体吸收 , 使得供体的荧光强度 减弱而受体荧光强度增强 , 利用荧光信号强弱变化积累实时 监测整个 PCR 反应过程 , 最后通过标准曲线对未知模板进行 定量分析 。实时荧光定量 PCR 技术已广泛应用

29、于多种食品微生物 污染 的 检 测 。 SE O 等 利 用 阪 崎 肠 杆 菌 部 分 大 分 子 合 (MMS 光定量 PCR 方法 , 能检测到 0. 6g 21, 比传统培养法检测时间从 68株阪崎肠杆菌和 ,阴性 ,4 小结生儿疾患 , 死亡率高达 50%以上 , 已引起了 F AO /WHO及各 国的高度重视 。 近几年国内也有陆续报道 , 根据笔者搜索到 有关阪崎肠杆菌的文献资料 , 国内外报道最多的是食品安全 问题 , 临床医学界尚未引起足够的重视 , 对阪崎肠杆菌对人体 的致病因素 、 致病机理尚未深入研究 ; 阪崎肠杆菌是条件致病 菌 , 在外界环境中的存在有较多研究 ,

30、但对人体正常菌群中阪 崎肠杆菌的分布 、 阪崎肠杆菌的传播 、 流行 、 耐药等缺少相关 资料 。 通过本文对阪崎肠杆菌的主要生物学性状 , 致病因素 , 所致疾病 、 培养检测方法等作了简要综述 , 望能引起医学界同 仁的广泛关注 , 起到抛砖引玉作用 。【 参考文献 】1S AK AZ AKI R, Bergeys manual of deter m inative bacteri ol ogyM.8th ed . I n BUCHANAN R E and GI B BONS N E . Balti m ore: W illia m s&W ilkins Co . , 1974:3

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