细菌形态检查

1、实验一 细菌形态检查【目的】掌握示教显微镜下所看到的细菌形态和特殊结构。掌握细菌涂片制作，革兰染色操作。掌握油镜的使用和保护方法，以便娴熟应用油镜观察细菌形态或结构。一、显微镜油镜的使用和保护法(一)显微镜油镜的识别(1)油镜头上都有标记：标有100×或90×；(2)有白、黑或红色圆圈；(3)有“油”或HI、oil字。油镜头比其它接物镜长，孔径最小。(二)显微镜油镜的使用使用显微镜油镜时，勿使镜台倾斜，以免镜油流出。在玻片标本上加香柏油(镜油)一滴，置载物台上，使有标本处对准聚光器中央(如肉眼看不清标本所在位置，应先用低倍镜观察)，用移动器或用固定夹固定。眼睛从物镜侧面注视

2、，右手转动粗调节器，使载物台上升，油镜头慢慢浸入油中，并几乎与玻片接触，但切勿压及玻片，以防损坏油镜头。将聚光器升高，光圈开大，然后眼观镜筒内，两手转动反光镜采光，使视野内光线明亮。若光源为灯光或阴天采自然光时，则使用凹面镜。眼观镜筒内，右手持粗调节器，缓慢下降载物台，当看到模糊物象时，再用细调节器调整看清物象。操作时严防油镜头与玻片相撞。(三)油镜的保护显微镜是贵重精密仪器，使用时要精心保护，不得随意拆散和碰撞。取送显微镜时，右手持镜臂，左手托镜座，平端于胸前，然后轻放于桌面上或柜箱内。 油镜用毕，载物台下降，取出标本片，用擦镜纸将油镜上的油擦净，(用擦镜纸蘸二甲苯擦试，再用擦镜纸擦去二甲苯

3、)擦镜时应顺其直径方向擦，不要转圈擦。不用时，将镜头转离聚光器，油镜头朝前呈“八”字形，降下聚光器，对号放入镜箱。标本片按规定擦去镜油，放入标本盒，如该标本片不再使用，则投入消毒缸内。防止与强酸、强碱、乙醚、氯仿、酒精等化学药品接触。(四)油镜加油的原理由于细菌个体小，必须使用90×或100×的物镜，以保证足够的放大倍数，同时为保证足够的亮度，必须滴加香柏油(因香柏油与玻璃的折光率相近似)，由聚光器出来的光线通过玻璃和镜油，不发生折射，直接进入镜筒，光路见下图所示。 油镜加油的原理二、细菌不染色标本检查法【材料】变形杆菌、葡萄球菌(812h)肉汤培养物。凹玻片、载玻片、盖玻

4、片、凡士林、接种环、酒精灯。【方法】压滴法 取一张洁净载玻片，用接种环取葡萄球菌和变形杆菌幼龄菌液各23环，分别置于玻片二端，加盖玻片，先用低倍镜对光，再用高倍镜观察细菌动力形态。由于不是染色标本，光线宜暗，即降低聚光器，缩小光圈。悬滴法在凹玻片的凹窝周围涂少许凡士林，用接种环取变形杆菌和葡萄球菌菌液，分别置于一盖玻片中央，将凹窝对准盖玻片反扣在盖玻片上，将二者压紧后迅速反转，使菌液悬于盖玻片。静置片刻后，先用低倍镜，再换高倍镜观察。观察时光线不宜过强，适当降低聚光器，缩小光圈，以利观察。悬滴标本的制作暗视野法取下显微镜上原有的明视野聚光器，换装暗视野聚光器；取23环菌液置于载玻片上，加盖玻片

5、(同压滴法)；在暗视野聚光器上加镜油；置标本片于载物台上，上升聚光器，使其上面的镜油与载玻片接触；转动反光镜，使光线集中于聚光器上；用低倍镜观察，当视野中有一圆形光环出现时，转动聚光器上的调节螺旋，将光环移至视野中央；换高倍镜观察，用细调节器调节清晰；若用油镜观察，则在盖玻片上加镜油。【结果】 有鞭毛细菌运动的特点是：有明显的定向运动，从一处泳至另一处（变形杆菌）。无鞭毛细菌运动的特点是：呈原位的颤动，为环境中液体分子冲击造成（葡萄球菌）。三、细菌的基本形态观察（绘图）注意细菌的大小(放大 倍)、形状、排列、染色性。葡萄球菌 链球菌脑膜炎奈瑟菌大肠埃希菌 白喉棒状杆菌炭疽芽胞梭菌霍乱弧菌幽门螺

6、杆菌四、细菌的特殊结构观察（绘图） 荚膜 芽胞 鞭毛 肺炎链球菌 破伤风芽胞梭菌 伤寒沙门菌 （注意荚膜和菌体） （注意芽胞的形状和位置） （注意鞭毛的位置、数量）五、细菌涂片的制作【目的】 细菌材料须涂布固定于玻片上，经染色后才能观察其形态、结构及染色反应。【原理】 细菌的化学成分以胶体原浆蛋白为主，涂布在玻片上经火焰温热后可固定于玻片，再经染色冲洗即可被染上颜色，且不易被水冲洗掉。【材料】 葡萄球菌、大肠埃希菌培养物、玻片、生理盐水、接种环、酒精灯、火柴、消毒缸。 【方法】 (1)涂片：于洁净载玻片两端各加一接种环生 葡萄球菌 大肠埃希菌 理盐水； 以无菌操作法，分别将二种细菌涂布于盐水中

7、。(如取肉汤培养物涂片，则载玻片上不必加生理盐水)。干燥：让所涂标本自然干燥或于火焰高处烘干，但切 细菌涂片制作勿将涂膜烤焦。固定：将标本通过火焰三次(涂有标本的一面朝上)。【注意事项】玻片要洁净无油，否则菌液不易涂开。不宜选用厚玻片，以免观察时视野难以调清。 取菌量宜少，涂片要匀而薄。水洗时要以细流水徐缓冲洗，避免直接冲洗涂菌处，切勿将未经火焰固定的标本立即染色水洗。六、革兰染色【材料】葡萄球菌、大肠埃希菌培养物。革兰染色液：结晶紫、卢戈碘液、95乙醇、稀释复红。接种环、酒精灯、载玻片、强光灯、显微镜、香柏油(镜油)及拭镜纸等。【方法】将细菌标本固定后，先用结晶紫（或龙胆紫）初染，再加碘液媒液，此时各种细菌均被染成深紫色。然后用95乙醇脱色，其中有的细菌脱去紫色，有的仍然保持紫色。最后用沙黄（或复红）液复染。通过革兰染色将细菌分成两大类：不被乙醇脱色仍保留紫色者为革兰阳性菌（G）；被乙醇脱色后再被复染成红色者为革兰阴性菌（G）。（1min） （1min） (约30秒) （30秒）结晶紫染液 水洗 卢戈碘液 水洗 95%乙醇 水洗 稀释复红 水洗 细菌涂片干燥 + 结晶柴 【注意事项】要掌握好染色时间，尤其是酒精脱色时间，不宜过长或过短，不可使染液干涸。选用适龄培养物，以1824小时为宜，否则影响染色效果。细菌染色标本观察后应放入指